產(chǎn)品目錄

本試劑盒通過堿裂解法裂解細(xì)胞，新型的硅基質(zhì)膜專一結(jié)合DNA，在特定條件下，有效去除內(nèi)毒素、基因組DNA、RNA、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。每次可抽提1～4mL菌液，抽提獲得的質(zhì)粒量會(huì)受質(zhì)粒拷貝數(shù)，細(xì)胞培養(yǎng)濃度等因素影響。由本試劑盒所得的質(zhì)粒可直接用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染，DNA測序，PCR，基于PCR的突變，體外轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)化細(xì)菌，內(nèi)切酶消化等下游實(shí)驗(yàn)。

保存條件：

室溫條件下，可保存12個(gè)月，更長時(shí)間保存可置于4℃。若溶液產(chǎn)生沉淀，可在室溫下放置一段時(shí)間，或在37℃水浴中預(yù)熱10min，以溶解沉淀。

使用建議：

如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)粒或大10kb的大質(zhì)粒，應(yīng)加大菌體使用量，使用5～10mL過夜培養(yǎng)物，同時(shí)按照比例增加P1、P2、P3的用量，洗脫緩沖液EB應(yīng)在65～70℃水浴預(yù)熱，在吸附和洗脫時(shí)可以適當(dāng)?shù)难娱L時(shí)間，以增加提取效率。其它步驟相同。

注意事項(xiàng)：

溶液P1（Buffer P1)在使用前先加入RNase A（全部加入），混勻，4℃保存。

漂洗液PW（Buffer PW)使用前應(yīng)加入48mL無水乙醇。

溶液P2（Buffer P2)低于室溫會(huì)產(chǎn)生沉淀，使用前應(yīng)檢查是否出現(xiàn)渾濁，如有渾濁現(xiàn)象，50℃水浴加熱溶解。溶液P2（Buffer P2)使用后請擰緊瓶蓋。

溶液P2和P3對人體有刺激性，操作時(shí)請小心，不要直接接觸。

提取的質(zhì)粒量與細(xì)菌培養(yǎng)濃度、質(zhì)粒拷貝數(shù)等因素有關(guān)。

去蛋白液PE可以有效去除殘留的蛋白污染，當(dāng)宿主菌為endA+ （TG1、BL21、HB101、ET12567、JM系列）等核酸酶含量較高的菌株時(shí)，烈推薦使用去蛋白液PE。

操作步驟：

漂洗液PW在使用前按照試劑瓶所示體積加入無水乙醇，混合均勻。

取1～4mL過夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，室溫下10000rpm離心1min，收集菌體，并盡可能地吸盡上清。

向留有菌體沉淀的離心管中加入250μL溶液P1（Buffer P1) （請先檢查是否已加入RNase A），使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌沉淀。

向離心管中加入250μL溶液P2（Buffer P2)，輕輕顛倒離心管10次以混合均勻，然后靜置5min至溶液粘稠而澄清。

注意：不要?jiǎng)×艺鹗帲悦庠斐伤豳|(zhì)粒中基因組DNA污染。此時(shí)菌液應(yīng)變得清亮粘稠，所用時(shí)間不應(yīng)過5min，以免質(zhì)粒受到破壞。如果溶液未變得清亮，可能菌體量過多，裂解不徹底，應(yīng)減少菌體量。向離心管中加入250μL溶液P2，輕輕顛倒離心管混勻6～8次，使菌體充分裂解。

向離心管中加入350μL溶液P3（Buffer P3)，立即上下顛倒混勻6～8次，此時(shí)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。室溫下13000rpm離心10min。

注意：P3加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。

小心吸取上清液轉(zhuǎn)移到帶有收集管的吸附柱中，室溫下13000rpm離心1min，移除收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。

注意：洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50μL，體積過小影響回收效率。洗脫液的pH值對于洗脫效率有很大影響。若后續(xù)做測序，需使用ddH2O做洗脫液，并保證其pH值在7.0～8.5范圍內(nèi)，pH值低于7.0會(huì)降低洗脫效率。且DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防DNA降解。為了增加質(zhì)粒的回收率，可將得到的溶液重新加入吸附柱中，再次離心收集。

向吸附柱中加入500μL溶液PE（Buffer PE)，室溫下13000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管。

注：溶液PE（Buffer PE)可以有效去除殘留的蛋白污染，當(dāng)宿主菌為endA+ （TG1、BL21、HB101、ET12567、JM系列）等核酸酶含量較高的菌株時(shí)，烈推薦使用Buffer PE。

向吸附柱中加入500μL溶液PW（Buffer PW)（請先檢查是否已加入無水乙醇），室溫下13000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。

重復(fù)操作步驟7。

將吸附柱放入收集管中，打開蓋子，室溫下13000rpm離心5～10min，目的是將吸附柱中殘留的乙醇去除。

注意：漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)（酶切、PCR等）實(shí)驗(yàn)，建議將吸附柱CM開蓋，置于室溫放置數(shù)分鐘。

將吸附柱轉(zhuǎn)移至一個(gè)的1.5mL離心管中，向吸附膜的中間部位滴加50～100μL洗脫液EB（Buffer EB)或ddH2O，室溫放置2min，13000rpm離心1min，收集洗脫液。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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