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產品名稱	英文名稱	規格	貨號
全血基因組DNA提取系統(沉淀法)	Blood Genomic DNA Extraction Kit (Ethanol precipitation)	50T\|200T	CS-01F96566

本試劑盒適用于處理新鮮的或已經添加抗凝劑的血液樣品，采用異丙醇沉淀方法，操作簡便，尤其適合大量提取血液基因組DNA。提取的DNA可用于PCR、酶切等常規分子生物學實驗。少量樣本也可選購我公司吸附柱型試劑盒(全血基因組，貨號QN0893)。

保存：室溫(15℃～25℃)干燥，有效期12個月。

注意事項：

樣品應避免反復凍融，否則會導致提取的DNA片段較小且提取量也下降。

若試劑盒中的溶液出現沉淀，可在65℃水浴中重新溶解后再使用，不影響提取效果。

使用前請根據使用量將10×紅細胞裂解液用水稀釋成1×的即用型紅細胞裂解液。

使用方法：

本操作步驟以1mL全血為例

樣品的處理：在血液中加入3倍體積的1×紅細胞裂解液(請確認已經稀釋過)，充分顛倒混勻，12000rpm離心1min(如為大量提取并且為大離心機，可11000轉離心5min)，小心吸去上清，再加入2倍體積的1×紅細胞裂解液，用移液器輕輕吹打沉淀，充分混勻，離心，棄上清，沉淀為白細胞。

向沉淀中加500μL白細胞裂解液，振蕩或者用移液器吹打至徹底混勻。65℃水浴10～20min，期間可顛倒離心管混勻數次，直至溶液較為清澈看不見明顯細胞為止。

加入500μL蛋白沉淀液，充分顛倒混勻，此時會出現白色沉淀，65℃水浴5min，12000rpm離心5min，小心吸取上清(不要吸到下層沉淀或漂浮不溶物)，轉移到干凈離心管中，如還有沉淀物，可再次離心。

在上清中加入1mL異丙醇，混勻。12000rpm離心5min，可看到管底有少量白色DNA沉淀，棄掉上清。

向離心管中加入1mL 75%乙醇，12000rpm離心5min，棄去上清液。可再次短暫離心用移液器去除殘余上清。

將離心管敞口置于室溫或50℃溫箱放置數分鐘，否則乙醇可能影響后續的實驗如酶切、PCR等。

向離心管中加入100～300μL DNA溶解液，室溫放置讓DNA自然溶解。如果DNA難于溶解，可室溫放置過夜或將離心管置于50～60℃水浴中水浴加熱5min。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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