產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號(hào)
酵母質(zhì)粒小量提取試劑盒(1～5mL)	Yeast Plasmid Extraction Kit	50T\|100T	CS-01F96564

本試劑盒采用酶法破碎酵母細(xì)胞壁和堿裂解法裂解酵母細(xì)胞來提取酵母質(zhì)粒DNA。所采用的酵母破壁酶能有效地破壞酵母細(xì)胞壁，提高酵母質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量。吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料能高效、專一地吸附DNA，可大限度去除雜質(zhì)蛋白質(zhì)及細(xì)胞中其他有機(jī)化合物。使用本試劑盒提取的酵母質(zhì)粒DNA可適用于各種常規(guī)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，包括酶切、PCR、測(cè)序、連接和轉(zhuǎn)化等試驗(yàn)。本試劑盒無需使用酚、氯仿等有毒試劑，操作安全。

注意：使用前請(qǐng)先在漂洗液中加入無水乙醇，加入體積請(qǐng)參照瓶體上的標(biāo)簽。YP1在使用前先加入RNaseA（將試劑盒中提供的RNaseA全部加入），混勻，置于2～8℃保存。如非指明，所有離心步驟均為使用臺(tái)式離心機(jī)在室溫下離心。

保存條件：

室溫（15℃～25℃）干燥保存，復(fù)檢期為12個(gè)月。2℃～8℃保存時(shí)間更長(zhǎng)。

注意事項(xiàng)：

溶液YP1在使用前先加入RNaseA(將試劑盒中提供的RNaseA全部加入)，混勻，置于2～8℃保存。

次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說明在漂洗液中加入無水乙醇配制成工作液(向15mL的漂洗液中加入60mL的無水乙醇)。

使用前請(qǐng)先檢查溶液YP2和溶液YP3是否出現(xiàn)混濁，如有混濁現(xiàn)象，可在37℃水浴中加熱幾分鐘，待溶液恢復(fù)澄清后再使用。

溶液YP2、溶液YP3和漂洗液使用后應(yīng)立即蓋緊蓋子，如非指明，所有離心步驟均為使用臺(tái)式離心機(jī)室溫下進(jìn)行離心。

質(zhì)粒得率與酵母菌株、質(zhì)粒拷貝數(shù)、培養(yǎng)條件等因素有關(guān)。通常酵母質(zhì)粒拷貝數(shù)都很低，因此質(zhì)粒得率一般為每5mL菌液提取1μg左右。

洗脫緩沖液的體積好不少于50μL，體積過小會(huì)影響回收效率；洗脫液的pH值對(duì)洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在8.0左右(可用NaOH將水的pH值調(diào)至此范圍)，pH值低于7.0會(huì)降低洗脫效率。

操作步驟：

取1～5mL酵母培養(yǎng)物（不過5×107cells），12000rpm離心1min，盡量吸除上清（菌液較多時(shí)可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中）。

酵母細(xì)胞壁的破除：

酶法：向酵母菌體中加入470μLBuffer，充分懸浮菌體，加入25μL酵母破壁酶和5μL巰基還原劑，充分混勻，30℃處理1-2h，期間可顛倒離心管混勻數(shù)次。12000rpm離心1min，棄上清，收集沉淀。向沉淀中加入250μL YP1（請(qǐng)先檢查是否已加入RNaseA），充分懸浮沉淀。

注意：如果菌塊未徹底混勻，會(huì)影響裂解導(dǎo)致質(zhì)粒提取量和純度偏低。

玻璃珠法：向酵母菌體中加入250μL YP 1（請(qǐng)先檢查是否已加入RNaseA），充分懸浮沉淀。加入150～200μL酸洗玻璃珠（自備），漩渦振蕩10min。簡(jiǎn)短離心使玻璃珠沉降到離心管底，吸取上清（如上清有所損失，請(qǐng)用YP 1補(bǔ)足至250μL）于另一干凈離心管中。

向離心管中加入250μL YP2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6～8次使菌體充分裂解。

注意：混勻一定要溫和，以免污染細(xì)菌基因組DNA，此時(shí)菌液應(yīng)變得清亮粘稠，作用時(shí)間不要過5min，以免質(zhì)粒受到破壞。

向離心管中加入350μL YP3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6～8次，充分混勻，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000rpm離心10min，用移液器小心地將上清轉(zhuǎn)移到另一個(gè)干凈的離心管中，盡量不要吸出沉淀。

注意：YP3加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。

將上一步所得上清液加入吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

向吸附柱中加入600μL漂洗液(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

向吸附柱中加入600μL漂洗液，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

12000rpm離心2min，將吸附柱敞口置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會(huì)影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)如酶切、PCR等。

將吸附柱放入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加50～200μL經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，室溫放置2min，12000rpm離心1min。

為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm離心1min。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

在線咨詢

留言注意事項(xiàng)：

1.遵守中華人民共和國(guó)有關(guān)法律、法規(guī)，尊重網(wǎng)上道德，承擔(dān)一切因您的行為而直接或間接引起的法律責(zé)任。

2.請(qǐng)您真實(shí)的反映產(chǎn)品的情況,不要捏造、誣蔑、造謠。如對(duì)產(chǎn)品有任何疑問,也可以留言咨詢。

3.未經(jīng)本站同意，任何人不得利用本留言簿發(fā)布個(gè)人或團(tuán)體的具有廣告性質(zhì)的信息或類似言論。

您感興趣的產(chǎn)品*
您的單位*
聯(lián)系人*
聯(lián)系電話*
詳細(xì)地址*
常用郵箱*
請(qǐng)輸入您對(duì)我們的意見或建議*
驗(yàn)證碼*