產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號
質(zhì)粒大量提取試劑盒(50～100mL)	Plasmid DNA Extraction Maxi Kit(50-100mL)	10T	CS-01F96560

本試劑盒采用堿裂解法裂解細(xì)胞，根據(jù)離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異性地結(jié)合溶液中的DNA的原理特異性提取質(zhì)粒DNA。離心吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料能高效、專一地吸附DNA，可大限度去除雜質(zhì)蛋白及細(xì)胞中其他有機(jī)化合物，一般從50～100mL大腸桿菌LB培養(yǎng)液中，可快速提取200～300μg高純度高拷貝的質(zhì)粒DNA，提取率達(dá)85～90%。使用本試劑盒提取的質(zhì)粒DNA可適用于各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、測序、連接和轉(zhuǎn)化等試驗(yàn)。

注意：

使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶體上的標(biāo)簽。溶液Ⅰ在使用前先加入RNase A（將試劑盒中提供的RNase A全部加入），混勻，置于2～8℃保存。如非指明，所有離心步驟均為使用臺式離心機(jī)在室溫下離心。

保存：常溫保存，復(fù)檢期一年。

操作步驟：

收集50～100mL過夜培養(yǎng)的菌液11000rpm離心10分鐘，盡量吸除上清(菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中)。

向留有菌體沉淀的離心管中加入5mL溶液Ⅰ (請先檢查是否已加入RNaseA)，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀。

注意：如果菌塊未徹底混勻，會影響裂解導(dǎo)致質(zhì)粒提取量和純度偏低。

向離心管中加入5mL溶液Ⅱ，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6～8次使菌體充分裂解。

注意：

① 翻轉(zhuǎn)一定要溫和，以免污染細(xì)菌基因組DNA。

② 作用時間不要過5分鐘，以免質(zhì)粒受到破壞。

向離心管中加入7mL溶液Ⅲ，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6～8次，充分混勻，此時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀(如菌液過多，可在此步放置5分鐘，以盡可能的降解RNA)。11000rpm離心10分鐘，用移液器小心地將上清轉(zhuǎn)移到另一個干凈的離心管中，注意盡量不要吸出沉淀。

注意：溶液Ⅲ加入后應(yīng)立即混勻，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。

將上一步所得上清液加入吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，室溫放置2～3分鐘，11000rpm離心30～60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中(如為提高得率，可將收集管中的液體加入吸附柱再次吸附一次)。

向吸附柱中加入8mL漂洗液(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，11000rpm離心2min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

向吸附柱中加入6mL漂洗液，11000rpm離心2min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

11000rpm離心5min，將吸附柱敞口置于室溫或50℃溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會影晌后續(xù)的實(shí)驗(yàn)如酶切、PCR等。

將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加1～2mL經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，室溫放置5min，11000rpm離心2min，收集質(zhì)粒溶液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置5min，11000rpm離心2min。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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