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本試劑盒適用于從新鮮或冷凍的干燥土壤、濕泥、淤泥及海河沉淀物中提取總DNA。本產品使用安全方便，單個樣品操作一般可在40分鐘內完成。使用本品每克土壤可獲得5μg以上的DNA，片段長度主要在20-30 kb之間。本試劑盒采用獨特的溶液能夠有效去除雜質和腐殖酸，通過優化的緩沖系統使裂解液中的DNA高效結合到吸附柱上，土壤中殘留的雜質、PCR和酶反應的抑制劑可通過兩步洗滌步驟有效去除，后使用低鹽緩沖液或水洗脫，即可獲得高純度DNA。純化得到的DNA可以直接用于酶切、PCR、Real-Time PCR、文庫構建、Southern Blot、分子標記等下游實驗。

自備試劑：無水乙醇，70%乙醇。

實驗前準備及重要注意事項：

1、樣品應避免反復凍融，否則會導致提取的DNA片段較小且提取量也下降。

2、次使用前應按照試劑瓶標簽的說明先在Buffer PR、GW1和Buffer GW2中加入無水乙醇。

3、使用前請檢查Buffer SL和Buffer GLS是否出現結晶或者沉淀，如有結晶或者沉淀，請將Buffer SL和Buffer GLS于56℃水浴重新溶解。

操作步驟：

1、取0.1 g-0.3 g土壤樣本，置于離心管(自備)中，加入1ml Buffer SW，渦旋振蕩1-3分鐘(須將管底的土壤震起來)。12000rpm(～13400×g)離心1分鐘，倒掉上清。

2、加入750μl的70%乙醇，渦旋振蕩1分鐘(須將管底的土壤震起來)，12000rpm離心1分鐘，倒掉上清，用移液器將余液吸盡。

3、向沉淀中加入500μl Buffer SL，渦旋振蕩1-3分鐘(須將管底的土壤震起來)，65℃水浴20分鐘(可每隔5分鐘渦旋振蕩5秒)，12000rpm離心3分鐘，將上清移至新的離心管(自備)中。

4、向上清液中加等體積Buffer GLS，顛倒混勻15-25次，冰上放置5分鐘。12000rpm離心5分鐘。

注意：冰上放置后液體可能會凝結，屬正常現象。

5、將步驟4中所得上清加入到已裝入收集管的吸附柱DM中，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

注意：若一次不能加完溶液，可分多次轉入。

6、向吸附柱中加入500μl Buffer PR(使用前檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

7、向吸附柱中加入500μl Buffer GW1(使用前檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

8、向吸附柱中加入500μl Buffer GW2(使用前檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

注意：如需進一步提高DNA純度，可重復步驟8。

9、12000rpm離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱置于室溫數分鐘，以徹底晾干。

注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會影響后續的酶促反應(酶切、PCR 等)。

10、將吸附柱置于一個新的離心管(自備)中，向吸附柱的中間部位懸空加入50-100μlBuffer GE或滅菌水，室溫放置 2-5分鐘， 12000rpm離心1分鐘，收集DNA溶液，-20℃保存DNA。

儲存條件：室溫(15～30℃)。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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