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本試劑盒設計用于快速從同一個動物細胞或者組織樣品中同時提取分離基因組DNA和總RNA。獨特的裂解液迅速裂解細胞和滅活細胞RNA/DNA酶，然后裂解混合物DNA/RNA同時通過一個基因組DNA吸附柱，基因組DNA被吸附而RNA穿透濾過。DNA吸附柱上基因組DNA經過一系列漂洗-離心后洗脫得到純凈基因組DNA。濾過的RNA用乙醇調節(jié)結合條件后，RNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于RNA吸附柱上，再通過一系列快速的漂洗-離心洗脫得到純凈的RNA。無、氯仿DNA/RNA快速提取技術基礎上配合獨特的分離技術同時得到的RNA/基因組DNA純度高，互不干擾。得到的RNA不需要DNase消化，可直接用于反轉錄PCR、熒光定量PCR等實驗。基因組DNA也可以直接用于下游的Southern、酶切、PCR等各種試驗。

試劑盒特點：

1.完全不使用有毒的，氯仿等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。

2.快速，簡捷，單個樣品RNA/基因組DNA分離提取操作一般可在40分鐘內完成。

3.試劑盒的獨特吸附柱和配方確保有效清除基因組DNA殘留，一般情況下得到的RNA不需要DNase消化，可直接用于反轉錄PCR、熒光定量PCR等實驗。

4. 多次柱漂洗確保RNA/基因組DNA高純度，可直接用于下游各種實驗。

注意事項：

1. 所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可以達到13000rpm的傳統(tǒng)臺式離心機，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機。

2. 樣品處理量絕對不要過基因組吸附柱和和RNA吸附柱處理能力，否則造成DNA殘留或者產量降低。不同組織細胞種類RNA/DNA相差極大，例如胸腺脾臟DNA含量豐富，過5mg就會過柱子處理能力。COS細胞RNA含量豐富，過3×10^6細胞就會過柱子吸附能力。所以開始摸索實驗條件時，如果不清楚樣品DNA/RNA含量時寧可使用較少的樣品處理量，如細胞不過3～4×10^6，組織不過10mg。將來根據樣品試驗情況增加或者減少處理量。

3. 裂解液RLT Plus、抑制物去除液IR、去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。

4. 預防RNase污染，應注意以下幾方面：

1) 經常更換新手套。因為皮膚經常帶有細菌，可能導致RNase 污染。

2) 使用無RNase 的塑料制品和槍頭避免交叉污染。

3) RNA在裂解液RLT Plus中時不會被RNase降解。但提取后繼續(xù)處理過程中應使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小時，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分鐘，然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase。

4) 配制溶液應使用無RNase的水。（將水加入到干凈的玻璃瓶中，加入DEPC至終濃度0.1%( v/v)，37℃放置過夜，高壓滅菌。）

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術有限公司

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