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聯系人:高小姐
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詳細地址：上海嘉定區嘉羅公路1661
產品屬性：
| 產品名稱 | 英文名稱 | 規格 | 貨號 |
| 小量質粒快速提取試劑盒(1.5～4.5mL) | Fast Plasmid Mini Kit(1.5-4.5 ml) | 50次|100次|200次 | CS-01F96534 |
本試劑盒采用改進SDS-堿裂解法裂解細胞，離心吸附柱內的硅基質膜在高鹽、低pH值狀態下選擇性地結合溶液中的質粒DNA，再通過漂洗液將雜質和其它細菌成分去除，后低鹽、高pH值的洗脫緩沖液將純凈質粒DNA從硅基質膜上洗脫。
| 試劑盒特點： 離心吸附柱內硅基質膜全部采用進口世界著名公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復性好。克服了國產試劑盒膜質量不穩定的弊端。 快速、方便，不需要使用有毒的、氯仿等試劑，也不需要乙醇沉淀。獲得的質粒產量高、純度好，可以直接用于酶切、轉化、PCR、體外轉錄、測序等各種分子生物學實驗。 注意事項： 本試劑盒適用菌株為XL-1 Blue和DH5α等核酸酶含量低缺陷型菌株。所用菌株為JM系列、HB101等endA菌株或野生型菌株，核酸酶含量豐富，應購買本公司的高純度質粒小量快速提取試劑盒。 所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可以達到13000rpm的傳統臺式離心機，如Eppendorf 5415C或者類似離心機。 溶液P3中含有刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套，避免沾染皮膚、眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。 提取質粒的量與細菌培養濃度、質粒拷貝數等因素有關。一般高拷貝質粒，建議接種單菌落于1.5～4.5mL加合適抗生素的LB培養基，過夜培養14～16個小時，可提取出多達20μg的純凈質粒。如果所提質粒為低拷貝質粒或大于10kb的大質粒，應適當加大菌體使用量，使用5～10mL過夜培養物，同時按比例增加P1、P2、P3的用量，其它步驟相同。 得到的質粒DNA可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。OD260值為1相當于大約50μg/ml DNA。電泳可能為單一條帶，也可能為2條或者多條DNA條帶，這主要是不同程度的螺旋構象質粒泳動位置不一造成，與提取物培養時間長短、提取時操作劇烈程度等有關。本公司產品正常操作情況下基本螺旋可以過90%。 質粒DNA確切分子大小，必須酶切線性化后，對比DNA分子量Marker才可以知道。處于環狀或者螺旋狀態的的質粒，泳動位置不確定，無法通過電泳知道其確切大小。 洗脫液EB不含有螯合劑EDTA，不影響下游酶切、連接等反應。也可以使用水洗脫，但應該確保pH大于7.5，pH過低影響洗脫效率。用水洗脫質粒應該保存在-20℃。質粒DNA如果需要長期保存，可以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0），但是EDTA可能影響下游酶切反應，使用時可以適當稀釋。 操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項） 提示： ① 次使用前請先在漂洗液WB中加入量無水乙醇，充分混勻，加入后請及時在方框打鉤標記已加入乙醇，以免多次加入! ② 將RNase A全部加入溶液P1中，混勻，每次使用后置于2～8℃保存。 ③ 將溶液P3放在冰上預冷。 取1.5～4.5mL過夜培養的菌液，9000rpm離心30秒，盡可能的倒干上清，收集菌體。 收集過1.5mL菌液，可以離心棄上清后，在同一個1.5mL管內加入更多的菌液，重復步驟1，直到收集到足夠的菌體。 用250μL溶液P1重懸菌體沉淀，渦旋振蕩至徹底懸浮。 如果有未徹底混勻的菌塊，會影響裂解，導致提取量和純度偏低。 加250μL的溶液P2，溫和地上下翻轉4～7次使菌體充分裂解，室溫放置4分鐘。 溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免基因組DNA剪切斷裂！所用時間不應過5分鐘！以免質粒受到破壞。此時菌液應變得清亮粘稠，如果菌體少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要準確的5分鐘。 加350μL溶液P3，立即溫和地上下翻轉4～7次，充分混勻時會出現白色絮狀沉淀。 冰上靜置3～5分鐘，13000rpm離心10分鐘，小心取上清。 加入溶液P3后應該立即混勻，以免產生SDS的局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。 將上一步所得上清加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），13000rpm離心30～60秒，倒掉收集管中的廢液。 加入500μL漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12000rpm離心30秒，棄掉廢液。 加入500μL漂洗液WB，12000rpm離心30秒，棄掉廢液。 將吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。 取出吸附柱AC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加50μL洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在65～70℃水浴中加熱效果更好），室溫放置2分鐘，12000rpm離心1分鐘。如果需要較多量質粒，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，離心1分鐘。
洗脫體積越大，洗脫效率越高。如果需要質粒濃度較高，可以適當減少洗脫體積，但是小體積不應少于30μL，體積過小降低質粒洗脫效率，減少質粒產量。 |
原創作者：上海莼試生物技術有限公司
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