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一步法質粒小提試劑盒(0.5～5mL)

  • 產品貨號：CS-01F96532
  • 產品價格：電議
  • 產品產地：國產
  • 包裝類型:盒裝
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  • 品牌名稱:莼試
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簡介內容：一步法質粒小提試劑盒(0.5～5mL)現貨供應，價格實惠。

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一步法質粒小提試劑盒(0.5～5mL)

One-Step Plasmid Kit(0.5-5mL)

100次

CS-01F96532

本試劑盒采用一步式細菌裂解技術，只需要一種溶液處理即可以完成細菌裂解，并且裂解物可以直接上柱純化質粒DNA。

試劑盒特點：

一步式，提取一個樣品只需5分鐘左右，比傳統的堿變性方法快捷。

適用于高拷貝、中拷貝和低拷貝質粒的提取。適用于各種E.coli宿主菌。

質粒DNA產量跟經典堿變性法相當，一般1～5mL可以得到3～15μg（對低拷貝質粒）和5～35μg（對高拷貝質粒）。

所得質粒DNA呈螺旋結構的比例比堿變性法更高。

基因組DNA污染少。但由于操作太快，溶液中的RNase來不及降解RNA，一般會有少量RNA污染，但不影響后續實驗。

可以直接用于電泳、酶切、PCR、細菌轉化、分子克隆、測序等后續實驗

保存條件：

常溫運輸及保存(溶液A需要4℃保存)，有效期一年。

使用方法：

用塑料離心管收集0.5～5mL過夜培養的飽和新鮮菌液，室溫14000g離心半分鐘，棄上清（培養基）。也可以使用-20℃凍存的細菌沉淀和4℃放置過夜的飽和細菌培養液，但質?；厥招噬缘?。如果是中拷貝和高拷貝質粒，使用1.5mL菌液即可，如果是低拷貝質粒，好使用3～5mL菌液。常見質粒拷貝數請參考附表。

在細菌沉淀中加入700μL溶液A，充分吹打或渦旋振蕩半分鐘。

將裂解液全部轉移到離心吸附柱中，直接離心。如果靜置3～5分鐘后再離心，會提高質粒產量10%左右。

室溫14000g離心1分鐘，棄穿透液。如果使用3～5mL起始菌液，則此步的離心時間可以延長1分鐘以確保所有液體成功過柱，吸附柱中沒有殘留液體。

在離心吸附柱中加入700μL的通用洗柱液，室溫14000g離心半分鐘，棄穿透液。

室溫14000g離心半分鐘，甩盡殘留液體。

注意：此步不能省略。

將離心柱置于一個自備的1.5mL塑料離心管中，在離心柱中加入30～50μL DNA洗脫液2.0(對低拷貝質粒建議用30μL洗脫，對高拷貝質粒建議用50μL洗脫)。

 

室溫14000g離心半分鐘，離心管底溶液即質粒DNA，可以直接用于后續實驗（濃度測定、酶切、電泳和測序）或放冰箱長期保存。
實驗步驟：
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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