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細菌內毒素(脂多糖，LPS)是革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要成分。人們在研究革蘭氏陰性菌血癥和內毒素血癥的過程中，發現細菌內毒素在其中起著關鍵的作用，內毒素使機體免疫功能嚴重受損，進一步的發展可能引發膿毒性休克，彌散性血管內凝血，急性呼吸窘迫綜合癥，全身炎癥反應綜合癥或致命性多器官功能衰竭。因此，內毒素的清除對于人類疾病治療的注射型藥品、生物制品等都是必須的，尤其對于基因藥物、蛋白藥物、單抗克隆藥物、治療性疫苗、小分子化學藥物等生物制品的下游純化處理來說就顯得非常重要。

試劑盒特點：

1.高穩定性，高去除效率。

2.高結合力：> 2000,000 EU/mL。

3. pH范圍為5-10時，親和介質對內毒素的清除率在92%以上；pH值在7-8時，清除效率高。

4. 無需恒流泵即可調節流速。

5. 重復使用 5次不會改變柱子效果。

6. 使用方便，試劑盒中提供無熱原緩沖液，無熱原收集管及無熱原槍頭等。

7.適合純化對象為蛋白，多肽，抗體，多糖等。

8.可耐受試劑：20% DMSO，20% 乙醇，20% 甘油;1 M 尿素，300mM咪唑; 0.05% 吐溫-20，10mM DTT等。

儲存條件：常溫運輸，4℃保存，有效期一年。

使用方法：

1.樣品處理：樣品的pH值和離子度在內毒素去除的過程中起著重要作用。雖然結合內毒素的pH范圍在6-9，但是7-8的pH范圍是純化的佳范圍。合適的離子濃度可以降低非特異性吸附，0.15-0.5 M NaCl的條件可以得到一個很好的去除效率和低的樣品損失。所以，純化之前可以使用處理過的氯化鈉，0.1 M的氫氧化鈉或0.1 M鹽酸來調節離子度或pH值。

2.活化親和介質：將預裝柱置于鐵架臺，垂直固定，去除預裝柱頂部的蓋子，打開流速控制器，使保護液在重力作用下流干，加入5mL的(預冷)再生緩沖液，調節流速控制器，保持流速在0.25mL/min(或者10滴/min)，待再生緩沖液流干，再加入5mL 再生緩沖液，再重復操作兩次，確保體系保持無熱原(即內毒素)存在。即使是次使用也必須進行這一步操作。這步操作大約需要60分鐘完成。

3. 平衡親和介質：活化完畢后，加入6mL的(預冷)平衡緩沖液，調節流速控制器，保持流速在0.5mL/min，流干平衡緩沖液，再按此操作重復兩次。這步操作大約需要40分鐘完成。

4.內毒素清除：將流速控制器關閉，使用無熱原槍頭將樣品加入，打開控制器，控制流速不高于0.25mL/min，流出液體積達到1.5mL后，使用無熱原接收管接受樣品，樣品流干后，再加入1.5mL-3.0mL的(預冷)平衡緩沖液淋洗，收集淋洗液。檢測樣品濃度及內毒素水平。

5. 再次使用：如果流出樣品內毒素水平未能達到預期值，需要將預裝柱重新再生，按照步驟1 重新再生，然后上樣純化。

6. 儲存條件：如果預裝柱用完后需要保存，先用10mL 平衡緩沖液平衡柱子，待平衡液流干，加入1.5mL的再生緩沖液(含0.02%的疊氮化鈉)。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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