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凝膠法內毒素半定量試劑盒

  • 產品貨號：CS-01F96526
  • 產品價格：電議
  • 產品產地：國產
  • 包裝類型:盒裝
  • 采購熱度：241
  • 庫存：100
  • CAS號：
  • 方法：
  • 含量：10×0.1mL
  • 品牌名稱:莼試
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簡介內容：凝膠法內毒素半定量試劑盒現貨供應，價格實惠。

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標簽:凝膠法內毒素半定量試劑盒 10×0 1mL 

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凝膠法內毒素半定量試劑盒

Endotoxin semi-quantitative kit(Gel Method)

10×0.1mL

CS-01F96526

本試劑盒又稱鱟試劑，為鱟科動物東方鱟的血液變形細胞溶解物的冷凍干燥品。鱟試劑中含有C因子、B因子、凝固酶原、凝固蛋白原等。在適宜的條件下(溫度，pH值及無干擾物質)，細菌內毒素激活C因子，引起一系列酶促反應，使鱟試劑產生凝集反應形成凝膠。

儲存條件：常溫運輸，陰涼處避光保存，有效期兩年。

使用方法：

一、樣品溶液的制備

樣品的pH值應在6.0–8.0 之間，若出此范圍，需用無熱原緩沖液或0.1N氫氧化鈉、0.1N 鹽酸調節。若樣品中可能存在鱟實驗的干擾物質，見本說明書4.2“樣品的干擾實驗”。若樣品中可能含有導致鱟試劑中G 因子旁路反應的(1,3)β－D－葡聚糖，需選用不會對(1,3)β－D－葡聚糖起反應的特異性鱟試劑。

二：細菌內毒素標準溶液及對照液的準備

2.1細菌內毒素標準溶液(本試劑盒不提供)

 取細菌內毒素工作標準品1支，按《細菌內毒素工作標準品使用說明書》配制2λ ，1λ ,0.5λ,及0.25λ的一系列內毒素標準溶液(λ為鱟試劑靈敏度標示值)。備用。

 注：鱟試劑靈敏度復核實驗見本手冊其他常用實驗方案。

2.2 陰性對照液：即無內毒素水。

2.3 陽性對照液：即濃度為2λ的內毒素標準溶液。

2.4樣品陽性對照液：即添加濃度為2λ內毒素標準的樣品溶液。

三：內毒素檢測

3.1 鱟試劑的溶解：按標示量(本試劑盒為0.1mL/支)加無內毒素水于鱟試劑中，輕輕振搖使鱟試劑完全溶解。注意不要引起氣泡，溶解后的試劑應在10 min內使用(即配即用)。

3.2樣品溶液的制備

 樣品大有效稀釋倍數(MVD)的計算：

 MVD＝ C?L/λ

 λ：測試用鱟試劑靈敏度標示值(EU/mL)；L：樣品細菌內毒素限值；C：樣品濃度或樣品復溶后所得樣品濃度。當L 單位為EU/mL(溶液)時，C的單位為1mL/mL；當L單位為EU/mg或者EU/U時，C的單位為mg/mL或者U/mL。按照計算所得體積，加無內毒素水制備樣品溶液。

3.3 各反應管中分別加入0.1mL 陰性對照液，陽性對照液，樣品，或樣品陽性對照液。

 封閉管口，輕輕搖勻，垂直放入37℃的恒溫器中溫育60分鐘±2分鐘，溫育期間避免振動。

3.4 結果判斷

3.4.1 將試管從恒溫器中輕輕取出，緩慢倒轉180°。若管內的內容物呈堅實凝膠，不變形，不從管壁滑脫為陽性，記錄為(+)；不呈凝膠或雖生成凝膠但不能保持完整并從管壁滑脫為陰性，記錄為(－)。

 

3.4.2 只有當陰性對照管結果均為陰性，陽性對照管、樣品陽性對照管結果均為陽性，實驗方有效，否則無效。若陰性對照管為陽性，提示鱟試劑、無內毒素水或實驗器具可能受到污染。若陽性對照管為陰性，提示鱟試劑活性減失、內毒素標準溶液效價降低，鱟試劑的靈敏度或內毒素的效價標示不準確，或內毒素標準溶液的稀釋不正確。若樣品陽性對照管為陰性，提示反應體系內有干擾因素存在。
實驗步驟：
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產品僅用于科研
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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