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產品屬性：
| 產品名稱 | 英文名稱 | 規格 | 貨號 |
| 質粒小量抽提試劑盒(3mL) | Plasmid Mini Preparation Kit(3mL) | 50次|200次 | CS-01F96522 |
本試劑盒是一種用于從大腸桿菌中進行小量質粒快速抽提的離心柱式試劑盒。本試劑盒抽提所得到的質粒可直接用于轉染細胞，DNA測序，PCR，基于PCR的突變，體外轉錄，轉化細菌，內切酶消化等。
本試劑盒適用于常用的EndA-菌株DH5α、JM109和XL-1 blue等。對于EndA+菌株如JM110、BL21(DE3)、TG1和HB101等，可以順利完成質粒抽提，但從EndA+菌株中抽提獲得的質粒會有輕微的核酸酶污染，如果在內切酶緩沖液中37℃孵育1小時會導致質粒全部降解。從EndA+菌株中抽提質粒時推薦使用我公司的通用型質粒小量抽提試劑盒(YTB4001)、通用型質粒中量抽提試劑盒(YTB4002)和通用型質粒大量抽提試劑盒(YTB4003)。
| 野生型大腸桿菌中表達Endonuclease I，能切割并降解雙鏈DNA。編碼Endonuclease I的基因是endA，如果endA突變失活，其基因型會被標注為endA1，相應的突變菌株被稱為EndA-菌株，而野生型菌株則被稱為EndA+菌株。常見的EndA-和EndA+菌株參見附表1。從EndA+菌株中抽提的質粒，微量核酸酶和質粒結合而容易被共純化，導致容易降解。 本試劑盒采用了一種新型的離子交換柱。在特定條件下，使質粒能在離心過柱的瞬間，結合到質粒純化柱上，在一定條件下又能將質粒充分洗脫，從而實現質粒的快速純化。無需酚氯仿抽提，無需酒精沉淀，12個樣品只需不足30分鐘即可完成。 每個質粒純化柱可以結合的質粒量的上限約為20μg。每個純化柱可用于抽提1～5mL用LB培養過夜的大腸桿菌。抽提所得質粒的OD260和OD280比值一般在1.80左右。抽提獲得的質粒量會受質粒拷貝數等因素影響。抽提獲得的質粒DNA的OD260和OD280比值也會因菌種不同等原因而略有波動。 保存條件：室溫保存，一年有效。 注意事項： 次使用前把試劑盒提供的RNase A全部加到溶液I (懸浮液)中，混勻，并在瓶上做好標記。加入RNase A后4℃存放。 次使用前在溶液IV (洗滌液)中加入27mL無水乙醇，混勻，并在瓶上做好標記。 溫度較低時，溶液II和溶液III可能會有沉淀產生。使用前必須檢查一遍。如有沉淀，37℃水浴加熱溶解，混勻后使用。溶液II請勿過分劇烈混勻，否則會產生大量氣泡。 溶液II使用完后，一定要蓋緊瓶蓋，防止被空氣中二氧化碳酸化。 溶液II有堿性，溶液II、溶液III和溶液IV對人體有刺激性，操作時請小心，并注意適當防護以避免直接接觸人體或吸入體內。 本試劑盒所有操作均在室溫進行，操作時無需冰浴。所有離心也均在室溫進行。 廢液收集管在一次抽提中需多次使用，切勿中途丟棄。 使用說明： 取過夜菌1.5mL，5000g離心1分鐘收集細菌沉淀，棄上清。再重復一次，每管共收集3mL過夜菌沉淀。 通常大腸桿菌宜用LB培養過夜(16小時左右)至OD值為2～4。建議5000g(通常為5000rpm左右)室溫離心1分鐘，如沉淀不充分則適當延長離心時間。時間過長或離心速度過快會使沉淀過于緊密，不利于加入溶液I后散開沉淀。直接倒掉上清，再倒入約1.5mL菌液并重復上述操作，然后倒置于吸水紙上(可用普通草紙)，使液體流盡。如果細菌密度明顯偏低，可考慮使用更多菌液，再重復上述操作1～2次。對于高拷貝質粒所用菌量一般不能過5mL，對于低拷貝質粒所用菌量一般不能過10mL。過量的細菌會導致后續的裂解不充分。 每管加入250μL溶液I，重懸細菌沉淀。確保沉淀完全散開，無可見細菌團塊。 確認溶液I中已經添加了RNase A。高速度vortex 5～10秒或更長時間，懸起沉淀。一定要充分混勻，對著光亮處觀察應呈均勻的懸濁液，無明顯細菌團塊或絮塊。如果沒有vortex，可以用槍吹打沉淀使沉淀逐漸散開或用手指把沉淀彈開。 每管加入250μL溶液II，輕輕顛倒離心管4～6次，使細菌完全裂解，溶液透明。 切勿vortex！vortex或其它劇烈操作會導致基因組DNA斷裂，易導致終所得質粒被基因組DNA污染。顛倒4～6次后，溶液應變得透明，無團塊或絮狀物。如果加入溶液I后細菌沒有完全散開，那么顛倒4～6次后，可能還會有團塊或絮狀物。遇到有少量團塊或絮狀物產生的情況，可以增加顛倒次數3～5次，再室溫放置2～3分鐘，但總裂解時間不可過5分鐘。 每管加入350μL溶液III，隨即顛倒離心管4～6次混勻，可見白色絮狀物產生。 切勿vortex！顛倒次數也不宜過多，否則易導致終所得質粒的質量下降。 高速(13000rpm左右)室溫離心10分鐘。 離心后會產生白色沉淀。離心時準備好下一步需使用的質粒純化柱，廢液收集管，并在純化柱上做好標記。 將上一步驟離心后的上清倒入或吸入到質粒純化柱內。高速離心30～60秒，倒棄收集管內液體。 質粒倒入質粒純化柱后，可以不用等待，直接離心。倒棄收集管內的液體后，保留收集管繼續使用。 在質粒純化柱內加入750μL溶液IV，高速離心30～60秒，洗去雜質，倒棄收集管內液體。 加入溶液IV后可以不用等待，直接離心。倒棄收集管內的液體后，保留收集管繼續使用。 再高速離心1分鐘，除去殘留液體并使痕量乙醇完全揮發。 注意：倒棄收集管內液體后再離心，才能徹底去除微量的溶液IV。微量的溶液IV會影響質粒的質量。 將質粒純化柱置于潔凈1.5mL離心管上，加入50μL溶液V至管內柱面上，放置1分鐘。 溶液V需要直接加至管內柱面中央，使液體被純化柱吸收。如果不慎將溶液V沾在管壁上，一定要震動離心管，使液體滑落到管底，以便被純化柱吸收。也可以用重蒸水或Milli-Q級純水替代溶液V，但是水的pH應不小于6.5。溶液V加入后放置時間稍長，對于增加質粒產量會略有幫助。如想得到較高濃度的質粒，可以加入35μL溶液V洗脫。 高速離心1分鐘，所得液體即為高純度質粒。
通常所得質粒濃度為0.1～0.3mg/ml左右。如果想得到高濃度的質粒，可以采用常規的乙醇沉淀方法濃縮質粒。 |
原創作者：上海莼試生物技術有限公司
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