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本試劑盒適用于常用的EndA-菌株DH5A、JM109和XL-1 blue等。對于EndA+菌株如JM110、BL21(DE3)、TG1和HB101等，可以順利完成質粒抽提，但從EndA+菌株中抽提獲得的質粒會有輕微的核酸酶污染，如果在內(nèi)切酶緩沖液中37℃孵育1小時會導致質粒全部降解。從EndA+菌株中抽提質粒時推薦使用我公司的通用型質粒小量抽提試劑盒(YTB4001)、通用型質粒中量抽提試劑盒(YTB4002)和通用型質粒大量抽提試劑盒(YTB4003)。

野生型大腸桿菌中表達Endonuclease I，能切割并降解雙鏈DNA。編碼Endonuclease I的基因是endA，如果endA突變失活，其基因型會被標注為endA1，相應的突變菌株被稱為EndA-菌株，而野生型菌株則被稱為EndA+菌株。常見的EndA-和EndA+菌株參見附表1。從EndA+菌株中抽提的質粒，微量核酸酶和質粒結合而容易被共純化，導致容易降解。

本試劑盒采用了一種新型的離子交換柱。在特定條件下，使質粒能在離心過柱的瞬間，結合到質粒純化柱上，在一定條件下又能將質粒充分洗脫，從而實現(xiàn)質粒的快速純化。無需酚氯仿抽提，無需酒精沉淀，12個樣品只需不足60分鐘即可完成。

無需高速冷凍離心機，只需普通臺式高速離心機。所有操作均可在1.5mL離心管中完成。

每個質粒純化柱可以結合的質粒量的上限約為50μg。每個純化柱可用于抽提5～10mL用LB培養(yǎng)過夜的大腸桿菌。抽提所得質粒的OD260和OD280比值一般在1.80左右。抽提獲得的質粒量會受質粒拷貝數(shù)等因素影響。抽提獲得的質粒DNA的OD260和OD280比值也會因菌種不同等原因而略有波動。

保存條件：室溫保存，一年有效。

注意事項：

次使用前把試劑盒提供的RNase A全部加到溶液I (懸浮液)中，混勻，并在瓶上做好標記。加入RNase A后4℃存放。

次使用前在溶液IV (洗滌液)中加入27mL無水乙醇，混勻，并在瓶上做好標記。

溫度較低時，溶液II和溶液III可能會有沉淀產(chǎn)生。使用前必須檢查一遍。如有沉淀，37℃水浴加熱溶解，混勻后使用。溶液II請勿過分劇烈混勻，否則會產(chǎn)生大量氣泡。

溶液II使用完后，一定要蓋緊瓶蓋，防止被空氣中二氧化碳酸化。

溶液II有堿性，溶液II和溶液III對人體有刺激性，操作時請小心，并注意適當防護以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。

本試劑盒所有操作均在室溫進行，操作時無需冰浴。所有離心也均在室溫進行。

廢液收集管在一次抽提中需多次使用，切勿中途丟棄。

使用說明：

取過夜菌至3個1.5mL離心管中，5000g離心1分鐘收集細菌沉淀，棄上清。再重復一次，每管共收集3mL過夜菌沉淀。

通常大腸桿菌宜用LB培養(yǎng)過夜(16小時左右)至OD值為2-4。建議5000g(通常為5000rpm左右)室溫離心1分鐘，如沉淀不充分則適當延長離心時間。時間過長或離心速度過快會使沉淀過于緊密，不利于加入溶液I后散開沉淀。直接倒掉上清，再倒入約1.5mL菌液并重復上述操作，然后倒置于吸水紙上(可用普通草紙)，使液體流盡。如果細菌密度明顯偏低，可考慮使用更多菌液，再重復上述操作1～2次。對于高拷貝質粒所用菌量每管一般不能過5mL，對于低拷貝質粒所用菌量每管一般不能過10mL。過量的菌會導致后續(xù)的裂解不充分。

每管加入250μL溶液I，重懸細菌沉淀。確保沉淀完全散開，無可見細菌團塊。

確認溶液I中已經(jīng)添加了RNase A。高速度vortex 5～10秒或更長時間，懸起沉淀。一定要充分混勻，對著光亮處觀察應呈均勻的懸濁液，無明顯細菌團塊或絮塊。如果沒有vortex，可以用槍吹打沉淀使沉淀逐漸散開或用手指把沉淀彈開。

每管加入250μL溶液II，輕輕顛倒離心管4～6次，使細菌完全裂解，溶液透明。

切勿vortex！vortex或其它劇烈操作會導致基因組DNA斷裂，易導致終所得質粒被基因組DNA污染。顛倒4～6次后，溶液應變得透明，無團塊或絮狀物。如果加入溶液I后細菌沒有完全散開，那么顛倒4～6次后，可能還會有團塊或絮狀物。遇到有少量團塊或絮狀物產(chǎn)生的情況，可以增加顛倒次數(shù)3～5次，再室溫放置2～3分鐘，但總裂解時間不可過5分鐘。

每管加入350μL溶液III，隨即顛倒離心管4～6次混勻，可見白色絮狀物產(chǎn)生。

切勿vortex！顛倒次數(shù)也不宜過多，否則易導致終所得質粒的質量下降。

高速(13000rpm左右)室溫離心10分鐘。

離心后會產(chǎn)生白色沉淀。離心時準備好下一步需使用的質粒純化柱，廢液收集管，并在純化柱上做好標記。

將上一步驟離心后的上清倒入或吸入到質粒純化柱內(nèi)。高速離心30～60秒，倒棄收集管內(nèi)液體。再重復兩次，使三管質粒結合于同一純化柱上。

質粒倒入質粒純化柱后，可以不用等待，直接離心。倒棄收集管內(nèi)的液體后，保留收集管繼續(xù)使用。

在質粒純化柱內(nèi)加入750μL溶液IV，高速離心30～60秒，洗去雜質，倒棄收集管內(nèi)液體。

加入溶液IV后可以不用等待，直接離心。倒棄收集管內(nèi)的液體后，保留收集管繼續(xù)使用。

再高速離心1分鐘，除去殘留液體并使痕量乙醇完全揮發(fā)。

注意：倒棄收集管內(nèi)液體后再離心，才能徹底去除微量的溶液IV。微量的溶液IV會影響質粒的質量。

將質粒純化柱置于潔凈1.5mL離心管上，加入120μL溶液V至管內(nèi)柱面上，放置1分鐘。

溶液V需要直接加至管內(nèi)柱面中央，使液體被純化柱吸收。如果不慎將溶液V沾在管壁上，一定要震動離心管，使液體滑落到管底，以便被純化柱吸收。也可以用重蒸水或Milli-Q級純水替代溶液V，但是水的pH應不小于6.5。溶液V加入后放置時間稍長，對于增加質粒產(chǎn)量會略有幫助。

高速離心1分鐘，所得液體即為高純度質粒。

通常所得質粒濃度為0.1～0.3mg/ml左右。如果想得到高濃度的質粒，可以采用常規(guī)的乙醇沉淀方法濃縮質粒。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術有限公司

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