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本試劑盒適合提取1～5mL菌液，在堿裂解法裂解細(xì)胞的基礎(chǔ)上，采用獨(dú)特的硅基質(zhì)膜吸附技術(shù)和試劑配方，通過離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下高效專一的結(jié)合溶液中的質(zhì)粒DNA，每個(gè)吸附柱高可吸附30μg的質(zhì)粒DNA，并大限度的去除蛋白質(zhì)、基因組、RNA和其他雜質(zhì)。得到的質(zhì)粒DNA可直接用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染、PCR、酶切、測(cè)序、連接等生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。

儲(chǔ)存條件：室溫(15～30℃)。

自備試劑：無水乙醇。

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備及重要注意事項(xiàng)：

所有組分可在干燥、室溫（15～30℃）環(huán)境穩(wěn)定保存1年，將吸附柱置于2～8℃可保存更長時(shí)間，加入RNase A的Buffer P1置于2～8℃可穩(wěn)定保存6個(gè)月。

次使用前，將RNase A溶液全部加入到Buffer P1中，混勻，置于2～8℃保存，使用前需在室溫中放置一段時(shí)間，恢復(fù)至室溫后使用。

次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說明在Buffer PW中加入無水乙醇。

使用前若發(fā)現(xiàn)Buffer P2、Buffer N3、Buffer PB有沉淀，可在37℃水浴幾分鐘，即可恢復(fù)澄清（請(qǐng)勿劇烈晃動(dòng)Buffer P2）。

注意不要直接接觸Buffer P2、Buffer N3和Buffer PB，使用后應(yīng)立即蓋緊蓋子。

提取質(zhì)粒的量和純度與細(xì)菌培養(yǎng)濃度、菌株種類、質(zhì)粒大小、質(zhì)粒拷貝數(shù)等因素有關(guān)。

操作步驟：

取1～5mL過夜培養(yǎng)的菌液加入離心管（自備）中，13000rpm（~16200×g）離心30秒收集菌體沉淀，盡量吸棄上清。

向留有菌體沉淀的離心管中加入250μL Buffer P1（請(qǐng)先檢查是否已加入RNase A），使用移液器或渦旋振蕩器充分混勻，懸浮菌體沉淀。

注意：如果菌塊未徹底混勻，將會(huì)影響裂解效果，導(dǎo)致提取量和純度偏低。

向離心管中加入250μL Buffer P2，溫和地上下顛倒混勻4～6次，充分混勻使菌體裂解，此時(shí)溶液應(yīng)變得清亮粘稠。

注意：溫和混勻，不要?jiǎng)×艺鹗帲悦獯驍嗷蚪MDNA，造成提取的質(zhì)粒中混有基因組DNA片段。

此步驟所用時(shí)間應(yīng)不過5分鐘，避免質(zhì)粒受到破壞。

向離心管中加入350μL Buffer N3，立即溫和地上下顛倒混勻8～10次，充分混勻，此時(shí)應(yīng)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。13000rpm離心5分鐘。

注意：Buffer N3加入后應(yīng)立即混勻，避免產(chǎn)生局部沉淀。

將步驟4中所得的上清液轉(zhuǎn)移到已裝入收集管的吸附柱DM中，13000rpm離心30秒鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

向吸附柱中加入150μL Buffer PB，13000rpm離心30秒。

向吸附柱中加入400μL Buffer PW（請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇），13000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液。

將吸附柱置于一個(gè)新的離心管（自備）中，向吸附膜的中間部位加入50～100μL Buffer EB，室溫放置2分鐘，13000rpm離心1分鐘，將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。-20℃保存質(zhì)粒。

注意：

1）為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，室溫放置2分鐘，13000rpm離心1分鐘，將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。

2）質(zhì)粒拷貝數(shù)較低或＞10kb時(shí)，Buffer EB在65～70℃水浴預(yù)熱，可以增加提取效率。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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