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詳細地址：上海嘉定區嘉羅公路1661
產品屬性：
| 產品名稱 | 英文名稱 | 規格 | 貨號 |
| 無內毒素質粒大提試劑盒（100～300mL） | GoldHigh Endo-Free Plasmid Maxi Kit（100～300 ml） | 2次|10次 | CS-01F96518 |
本試劑盒提供一種簡單快捷高效提取無內毒素質粒的新方法，在堿裂解法裂解細胞的基礎上，采用獨特的硅基質膜吸附技術，高效專一的結合質粒DNA；同時采用特殊的緩沖液系統和去內毒素buffer，有效去除內毒素、基因組DNA、RNA、蛋白等雜質。每次可處理100～300mL菌液，獲得多至2mg轉染級質粒DNA，整個提取過程只需50分鐘。本試劑盒所得質粒純度高、提取量大，特別適用于細胞轉染，同時也可用于DNA測序，PCR，體外轉錄，內切酶消化等實驗。
| 內毒素是質粒提取中常見的污染物，由于真核細胞對內毒素非常敏感，因此，如果質粒中含有內毒素會大大降低真核細胞轉染效率。 保存：室溫(15～30℃) 自備試劑： 無水乙醇、異丙醇。 實驗前準備及重要注意事項： 所有組分可在干燥、室溫（15～30℃）環境穩定保存1年，將吸附柱置于2～8℃可保存更長時間，加入RNase A的Buffer P1置于2～8℃可穩定保存6個月。 Buffer P1在使用前先加入RNase A（將試劑盒中提供的RNase A全部加入），混勻，置于2～8℃保存。使用前需在室溫中放置一段時間，恢復至室溫后使用。 次使用前應按照試劑瓶標簽的說明在Buffer PW中加入無水乙醇。 使用前請先檢查Buffer P2和Buffer E3是否出現結晶或沉淀，如有結晶或沉淀現象，可在37℃水浴幾分鐘，即可恢復澄清。 注意Buffer P2和Buffer E3含有刺激性物質，請戴手套操作，使用后應立即蓋緊蓋子。 使用Buffer PS處理過的吸附柱好立即使用，避免放置時間過長影響使用效果。 提取質粒的量和純度與細菌培養濃度、菌株種類、質粒大小、質粒拷貝數等因素有關。 操作步驟： 取150mL過夜培養的菌液，加入離心管（自備）中，12000×g離心2～3分鐘收集細菌，盡量吸棄全部上清。 向留有菌體沉淀的離心管中加入12mL Buffer P1（請先檢查是否已加入RNase A） 使用移液器或渦旋振蕩器充分混勻，懸浮細菌沉淀。 注意：如果菌塊未徹底混勻，將會影響裂解效果，使提取量和純度偏低。 向離心管中加入12mL Buffer P2，溫和地上下顛倒混勻8～10次，使菌體充分裂解，室溫放置3～5分鐘。此時溶液應變得清亮粘稠。 注意：溫和混勻，不要劇烈震蕩，以免打斷基因組DNA，造成提取的質粒中混有基因組DNA片段。如果溶液未變得清亮，提示可能菌量過大，裂解不徹底，應減少菌體量。 向離心管中加入12mL Buffer E3，立即上下顛倒混勻8～10次，此時出現白色絮狀沉淀，室溫放置5分鐘。12000×g離心10分鐘，將上清轉移至干凈離心管（自備）中，注意不要帶入沉淀。 注意：Buffer E3加入后應立即混勻，避免產生局部沉淀。 加入0.3倍濾液體積的異丙醇，上下顛倒混勻。 注意：加入異丙醇過多容易導致RNA污染。 柱平衡：向已裝入收集管中的吸附柱DQ中加入2mL Buffer PS，12000×g離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。 將步驟5中液體與異丙醇的混合溶液轉移到平衡好的吸附柱DQ（已裝入收集管）中。12000×g離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。 注意：吸附柱的大容積為15mL，所以第7步中所得溶液分多次過柱。如果離心機轉子傾角較大時，建議加入吸附柱的溶液體積不過10mL，以防發生漏液現象。 向吸附柱中加入10mL Buffer PW（請先檢查是否已加入無水乙醇），12000×g離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液。 重復步驟8。 向吸附柱中加入10mL Endo-Free Buffer PW，12000×g離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。 將吸附柱重新放回收集管中，12000×g離心5分鐘，倒掉廢液，將吸附柱置于室溫數分鐘，以徹底晾干吸附柱中殘余的漂洗液。 注意：這一步的目的是將吸附柱中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會影響后續的酶促反應（酶切、PCR等）。 將吸附柱置于一個新的離心管中，向吸附膜的中間部位加入1～3mL Endo-Free Buffer EB，室溫放置2～5分鐘，12000×g離心5分鐘，將質粒溶液收集到離心管中。-20℃保存質粒。 注意： 1）為了增加質粒的回收效率，可將得到的溶液重新加入到吸附柱中，室溫放置2～5分鐘，12000×g離心5分鐘，將質粒溶液收集到離心管中。
2）質粒拷貝數較低或>10kb時，Endo-Free Buffer EB在65～70℃水浴預熱，可以增加提取效率。 |
原創作者：上海莼試生物技術有限公司
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