產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號(hào)
紅細(xì)胞裂解液B型(流式細(xì)胞分析用)	Red Cell Lysis Solution,Type B	250mL	CS-01F96512

介紹

本品用于快速裂解哺乳動(dòng)物全血中的紅細(xì)胞而基本不破壞白細(xì)胞和其他淋巴細(xì)胞的完整性和生物學(xué)活性。由于紅細(xì)胞是血液的主要細(xì)胞成份，不含DNA和RNA，其所含血紅素能抑制PCR反應(yīng)，所以先用本產(chǎn)品裂解紅細(xì)胞，再提取基因組DNA或RNA 有助于提高所得樣品純度。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.可以處理人全血、小鼠全血、脾細(xì)胞中的紅細(xì)胞。

2.高效，一次處理能裂解80%以上的哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞，能回收90%左右的白細(xì)胞。一般樣品多只需要處理兩次。

3.擴(kuò)容性好，可以一次處理多達(dá)幾十毫升的樣品，也可以處理100μL的血液。

4.基于NH4Cl 裂解法，得到的白細(xì)胞主要用于流式細(xì)胞分析。

儲(chǔ)存條件：常溫運(yùn)輸，4℃保存，有效期一年。

使用方法：

用去離子水將本產(chǎn)品(10×)稀釋為1×工作液(1mL 本產(chǎn)品加9mL去離子水)，待溫度回到室溫或37℃加熱到37℃的時(shí)候再使用。工作液不能長期放置，只能現(xiàn)配現(xiàn)用。

一．裂解哺乳動(dòng)物全血中的紅細(xì)胞

1.離心哺乳動(dòng)物抗凝血液后棄血漿部分，按每1mL 哺乳動(dòng)物抗凝血液細(xì)胞沉淀加10mL 1×工作液的比例加入紅細(xì)胞裂解液B型的1×工作液。

2. 輕柔吹打充分混勻。

3.室溫放置 15分鐘(注意：放置時(shí)間不要過15分鐘)。

4. 4℃1000rpm離心10分鐘，吸棄紅色的上清液。

5. 如果紅細(xì)胞裂解不完全，可以重復(fù)第 1-4 步。

6. 用適當(dāng)?shù)淖詡渚彌_液(如Hanks溶液)重懸白細(xì)胞沉淀。

7. 用于細(xì)胞計(jì)數(shù)和流式細(xì)胞分析等后續(xù)試驗(yàn)。

二．裂解組織細(xì)胞中的紅細(xì)胞

1. 按標(biāo)準(zhǔn)方法用自備的將組織消化成單個(gè)細(xì)胞懸液，離心棄上清。

2. 按 1：10的比例向細(xì)胞沉淀中加入紅細(xì)胞裂解液B型工作液，輕柔吹打均勻。

3.室溫放置 15分鐘(注意：放置時(shí)間不要過15分鐘)。

4. 4℃ 1000rpm離心10分鐘，吸棄紅色的上清液。

5. 如果紅細(xì)胞裂解不完全，可以重復(fù)第 2-4 步。

6. 用適當(dāng)?shù)淖詡渚彌_液(如 Hanks溶液)重懸白細(xì)胞沉淀。

7. 用于細(xì)胞計(jì)數(shù)和流式細(xì)胞分析等后續(xù)試驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。產(chǎn)品僅用于科研

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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