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本試劑盒可從新鮮全血中高效提取總RNA，可處理不同物種以及多種抗凝劑全血樣品。吸附柱中采用的硅基質材料為本公司特有新型材料，高效、專一吸附RNA，可大限度去除雜質蛋白。提取的RNA可用于RT-PCR、Real Time RT-PCR、芯片分析、高通量測序、Northern Blot、Dot Blot、Poly A篩選、體外翻譯、RNase保護分析和分子克隆等多種下游實驗。

產品特點：

適用于不同物種新鮮全血，操作簡單。

配有CS過濾柱，可有效去除雜質。

精心配置的緩沖液，保證RNA提取高效穩定，適用于多種下游實驗。

操作安全可靠，無需酚/氯仿抽提。

保存條件：室溫（15～25℃）保存，DNaseI，緩沖液RDD，2～8℃保存，加入β-巰基乙醇的裂解液RLH 4℃可放置一個月

自備試劑：

β-巰基乙醇、無水乙醇

預防RNase污染

經常更換新手套。因為皮膚經常帶有細菌，可能導致RNase污染。

使用無RNase的塑料制品和槍頭避免交叉污染。

RNA在裂解液RLH中時不會被RNase降解。但提取后繼續處理過程中應使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10min，然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase。

配制溶液應使用RNase-free ddH2O。（將水加入到干凈的玻璃瓶中，加入DEPC至終濃度0.1%（V/V)，混勻后放置過夜，高壓滅菌。)

注意事項：

操作前在RLH中加入β-巰基乙醇至終濃度1%，如1mL RLH中加入10μL β-巰基乙醇。此裂解液好現用現配。配好的RLH 4℃可放置一個月，裂解液RLH在儲存時可能會形成沉淀，如果有沉淀出現，請加熱溶解后使用。

次使用前應在漂洗液RW與去蛋白液RW1H中加入無水乙醇，加入量請參見瓶上標簽。

人類的血液或體液可能有潛在的感染性，所以如果對人類的全血進行處理，請注意做好防護措施。

本試劑盒多能處理1.5mL健康的人類全血（健康人的全血中白細胞含量為：多4000～7000個白細胞/μl血液)，如果血液中白細胞的含量較高，可按比例減少血液的用量，本試劑盒多可處理的白細胞數量為：1×107。

在白細胞裂解后，該說明書中的所有步驟需在室溫（15～25℃)進行，操作速度越快越好。

細胞溶解物（在裂解液RLH中)可以存放在-70℃，待使用時，將其置于37℃孵育10min，以保證所有的鹽都溶解，然后進行操作步驟第7步。

本試劑盒不適用于凍存的全血。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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