產(chǎn)品目錄

本試劑盒采用高效、專一結(jié)合核酸的離心吸附柱和獨(dú)特的緩沖系統(tǒng)，可從多種不同類型的微量樣品中快速提取總RNA。本試劑盒特別加入了Carrier RNA，可以從體系中輕松捕獲微量核酸,具有方便快捷、產(chǎn)量高、重復(fù)性好的特點(diǎn)，30-40分鐘內(nèi)即可完成反應(yīng)。與其它提取RNA的普通方法相比，微量樣品RNA提取試劑盒將所有<200bp的RNA（5.8S rRNA,5S rRNA和tRNAs等）選擇性的篩除，而所有>200bp的RNA則被富集、分離和純化。提取的總RNA純度極高，沒有DNA和蛋白質(zhì)污染。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

·從微量的樣本中純化得到的高質(zhì)量的RNA，如顯微切割得到的組織，纖維組織和細(xì)胞。

·配有高效的DNase Ⅰ，可有效去除DNA污染。

· RNA純度更高，無雜質(zhì)殘留，特別適合于對純度要求很高的下游實(shí)驗(yàn)。

·操作安全可靠，無需酚/氯仿抽提，無需氯化銫梯度離心，無需氯化鋰或乙醇沉淀。

儲(chǔ)存條件：在室溫（15-25℃)條件下運(yùn)輸，收到試劑盒后，請立即將RNase-free DNase I,緩沖液RDD和RNase-free ddH2O置于2-8℃保存，其他試劑可置于室溫（15-25℃)保存。

選配試劑：蛋白酶K（目錄號：WH0215）；研磨杵（目錄號：WH9004）；過濾柱CS：（目錄號：RK124）

自備試劑：β-巰基乙醇、無水乙醇

使用前注意事項(xiàng)：

1．為了防止RNA的降解，請避免未處理的樣品在室溫長時(shí)間放置，在組織固定前，RNA處于無保護(hù)狀態(tài)，所以請將組織在液氮中速凍。

2．組織裂解液（在裂解液RL中）可在-70℃儲(chǔ)存數(shù)月。處理凍存的裂解液時(shí)，可在室溫或37℃水浴中將樣品完全解凍，而且請注意裂解液中的鹽需要完全溶解，之后立即進(jìn)行后續(xù)操作。（長時(shí)間37℃處理將會(huì)導(dǎo)致RNA的化學(xué)降解）。

3．所有步驟在室溫進(jìn)行，為了盡量避免RNA的降解，操作越快越好。

4．在使用前，請用RNase-Free ddH2O配制乙醇溶液。

5．操作前在RL中加入β-巰基乙醇至終濃度1%，如1ml RL中加入10μl β-巰基乙醇。此裂解液好現(xiàn)用現(xiàn)配。配好的RL可在4℃放置一個(gè)月，裂解液RL在儲(chǔ)存時(shí)可能會(huì)形成沉淀，如果有沉淀出現(xiàn)，請加熱溶解后使用。

6．次使用前應(yīng)在漂洗液RW中加入無水乙醇，加入量請參見瓶上標(biāo)簽。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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