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本試劑盒是在無、氯仿RNA快速提取技術基礎上，又采用基因組DNA清除柱技術確保有效清除gDNA殘留，得到的RNA不需要DNase消化，可直接用于反轉錄PCR、熒光定量PCR等實驗。獨特的裂解液迅速裂解細胞和滅活細胞RNA酶，然后裂解混合物通過一個基因組DNA清除柱，基因組DNA被清除而RNA穿透濾過。濾過的RNA用乙醇調節結合條件后，RNA在高離序鹽狀態下選擇性吸附于離心柱內硅基質膜，再通過一系列快速的漂洗-離心的步驟，去蛋白液和漂洗液將細胞代謝物，蛋白等雜質去除，后低鹽的RNase free H20將純凈RNA從硅基質膜上洗脫。

試劑盒特點：

1.完全不使用有毒的，氯仿等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。

2.快速，簡捷，單個樣品操作一般可在30分鐘內完成。

3.獨特研發成功基因組DNA清除柱技術確保有效清除gDNA殘留，得到的RNA不需要DNase消化，可直接用于反轉錄PCR、熒光定量PCR等實驗。

4.多次柱漂洗確保高純度，OD260/OD280典型的比值達1.9～2.0，基本無DNA殘留，可用于RT-PCR，Northern-blot和各種實驗。

注意事項：

1.所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可以達到13000rpm的傳統臺式離心機，如Eppendorf 5415C或者類似離心機。

2.樣品處理量絕對不要過基因組吸附柱和和RNA吸附柱處理能力，否則造成DNA殘留或產量降低。開始摸索實驗條件時，如果不清楚樣品DNA/RNA含量時寧可使用較少的樣品處理量，將來根據樣品試驗情況增加或者減少處理量。

3.裂解液RLT Plus和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作時戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。

4.關于DNA的微量殘留:

一般說來任何總RNA提取試劑在提取過程中無法完全避免DNA的微量殘留（DNase消化也無法做到100%無殘留），本試劑盒提取產品，由于采取了本公司獨特的緩沖體系和基因組DNA清除柱技術，絕大多數DNA已經被清除，不需要DNase消化，可直接用于反轉錄PCR和熒光定量PCR。個別特殊情況如DNA含量過于豐富造成殘留或者要進行嚴格的mRNA表達量分析熒光定量PCR，我們建議在進行模板和引物的選擇時：

1)選用跨內含子的引物，以穿過mRNA中的連接區，這樣DNA就不能作為模板參與擴增反應。

2)選擇基因組DNA和cDNA上擴增的產物大小不一樣的引物對。

3)將RNA提取物用RNase-free的DNase I處理。本試劑盒還可以用于DNase I處理后的RNA清潔(cleanup)，請聯系我們索取具體操作說明書。

4)在步驟去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱上進行DNase I處理。請聯系我們索取具體操作說明書。

5.RNA純度及濃度檢測:

完整性：RNA可用普通瓊脂糖凝膠電泳(電泳條件：膠濃度1.2%；0.5×TBE電泳緩沖液；150v，15分鐘)檢測完整性。由于細胞中70%～80%的RNA為rRNA，電泳后UV下應能看到非常明顯的rRNA條帶。動物rRNA大小分別約為5kb和2kb，分別相當于28S和18S rRNA。動物RNA樣品中大rRNA亮度應為次大rRNA亮度的1.5～2.0倍，否則表示RNA樣品的降解。出現彌散片狀或條帶消失表明樣品嚴重降解。

純度：OD260/OD280比值是衡量蛋白質污染程度的指標。高質量的RNA，OD260/OD280讀數（10mMTris,pH7.5）在1.8～2.1之間。OD260/OD280讀數受測定所用溶液的pH值影響。同一個RNA樣品，假定在10mM Tris，pH7.5溶液中測出的OD260/OD280讀數1.8～2.1之間，在水溶液中所測讀數則可能在1.5～1.9之間，但這并不表示RNA不純。

濃度：取一定量的RNA提取物，用RNase-free水稀釋n倍，用RNase-free水將分光光度計調零，取稀釋液進行OD260,OD280測定，按照以下公式進行RNA濃度的計算：終濃度（ng/μl）= (OD260)×(稀釋倍數n)×40

儲存條件：室溫，有效期6個月

本制品別名：細菌RNA快速提取試劑盒|快速提取細菌RNA試劑盒

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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