產(chǎn)品目錄

本品是一種水相的，無(wú)毒的組織保存液體，可以迅速滲入新鮮組織細(xì)胞的胞漿中，在非凍狀態(tài)下原位穩(wěn)定和保護(hù)細(xì)胞內(nèi)的RNA。取下組織薄片后立刻浸入本品保存并不影響將來(lái)提取RNA的質(zhì)量和數(shù)量。本品消除了RNA樣品需要立刻處理或者必須液氮保存的不方便。浸入本產(chǎn)品后，新鮮組織細(xì)胞中RNA可以完好的在37℃下保存一天，在25℃下保存一周,4℃下保存一個(gè)月，在-20℃或-80℃下長(zhǎng)期保存。RNA病毒樣品(如HCV和HIV)可在37℃保存一個(gè)月。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.操作容易：將成適當(dāng)大小，浸沒(méi)在本品中即可使其RNA不被降解。

2.無(wú)需液氮：使樣品的保存不需液氮，干冰或-80℃冰箱，尤其適用于臨床和野外樣品的快速和大規(guī)模采集。

3.方便運(yùn)輸：處理過(guò)的樣品能在25℃保存一周，使樣品郵寄和運(yùn)輸變得容易和便宜，有利學(xué)術(shù)合作和交流。

4.多次凍融:經(jīng)本品處理的樣品可反復(fù)凍融多次，其間可對(duì)樣品進(jìn)行各種處理而不影響終提取的RNA的質(zhì)量。

5.比性:本品能減少大規(guī)模樣品處理中的誤差，增加各次實(shí)驗(yàn)數(shù)間的可比性，對(duì)大規(guī)模基因表達(dá)譜的分析尤其有用。

6.兼容性廣:多種總RNA提取試劑都可以用來(lái)提取保存在本品內(nèi)的樣品。還可直接用于組織切片，免疫學(xué)和流式細(xì)胞分析而不影響RNA提取的質(zhì)量。

使用方法：

本品只用于新鮮組織，浸泡入本品前禁止冷凍組織。只需要迅速將新鮮成長(zhǎng)，寬，高任意一邊厚度<0.5厘米浸泡入本品即可（只要有一邊厚度不過(guò)0.5厘米，本品可以迅速滲透，其它兩邊的尺寸并不重要）。將新鮮組織浸泡在5倍體積的本品中，按照指示存放在適當(dāng)?shù)臏囟取?/span>

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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