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本品是一種新型的冰凍組織過渡溶液，可以幫助解凍冰凍組織，同時保護RNA完整性，從而可以使冰凍組織轉變到普通的勻漿方法易于處理的狀態，以提取高質量的RNA。處理后的冰凍組織不需要在勻漿前將其碾磨成粉，甚至在勻漿前可以進一步對組織進行切割。加入RNAKeeper-ICE溶液后，組織從堅硬的冰凍狀態轉變為柔軟狀態，此時該溶液滲入組織，使RNA酶失活。用本品溶液處理后，組織可以在室溫下操作而不用擔心RNA會發生降解。而且，樣品能被安全的稱重，進一步切割，或者進行多種實驗而不影響RNA的質量。處理后的組織樣品可以直接加入到裂解溶液中破碎，也可以置于-20℃長期保存。

本產品適用于動物組織以及培養細胞、白細胞。經測試，可用于肝、腎、脾、肺、心、胸腺、胰等組織的保存。

本產品與基于異硫氰酸胍的RNA提取試劑如Total RNA Extraction Reagent, Trizol，或基于離心柱的RNA提取試劑盒兼容。

應用實例

1. 將本品在-70℃或-80℃預冷。

2. 樣品保存：

A.動物組織：按100 mg組織比不小于1 ml 本品的比例，將冰凍組織浸沒于預冷的本品中。注意：組織塊的厚度應不過0.5 cm，否則會影響本品的滲透效率，導致RNA穩定效果變差。

B.培養細胞、白細胞：收集細胞，用PBS清洗后加入至少10倍體積本品，蓋緊管蓋，上下顛倒數次。此時沉淀是否被完全懸浮對實驗無影響。

3. 將浸沒于本品的組織轉移至-20℃存放。至少16小時后，組織即可勻漿進入后續提取過程；若不立即勻漿，組織可繼續在-20℃穩定存放6個月。這個過程中，組織可從溶液中取出，在室溫進行切割、稱重等操作(注意在室溫暴露的時間不要過30分鐘)后繼續浸沒在本品中保存。

4. RNA提取：將組織取出，用鑷子輕輕擠掉多余的本品溶液，置于裂解液中，立刻勻漿。如果是細胞樣品，10000g，4℃離心1分鐘，棄上清，加入裂解液。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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