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DNase I(來源于牛胰腺)

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  • 產品價格：電議
  • 產品產地：國產
  • 包裝類型:盒裝
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  • 含量：15KU|10×15KU
  • 品牌名稱:莼試
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簡介內容：DNase I(來源于牛胰腺)現貨供應，價格實惠。

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標簽:DNase I(來源于牛胰腺) 15KU 10×15KU 

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DNase I(來源于牛胰腺)

Deoxyribonuclease I from bovine pancreas

15KU|10×15KU

CS-01F96411

本品來自牛，由四種色譜區分的組分A，B，C，D構成，摩爾比為4:1:1，而D組分非常少。分子生物學實驗中常用于清除蛋白中的DNA，或者用于向DNA中引入缺口使標記堿基插入DNA。本品以含氯化鈣的凍干粉形式供應，

背景資料：

DNase I一種發現于多種細胞和組織的核酸酶，屬核酸內切酶，靶向切割鄰近的磷酸二酯鍵，產生5’端為磷酸基團、3’端為羥基的多聚核苷酸，平均消化產物小為多聚四核苷酸。DNase可催化多種形式DNA，如單鏈DNA、雙鏈DNA，甚至染色質（其切割速率受組蛋白影響）。佳的工作范圍是pH7～8，DNase的活性依賴于Ca2+，并可被二價金屬離子如Co2+，Mn2+，Zn2+等激活。5mM Ca2+可保護酶使其不被水解。在Mg2+存在下，該酶可隨機識別和切斷DNA任一條鏈上的任意位點；而在Mn2+存在的條件下，可同時識別DNA的兩條鏈并在幾乎相同的位點進行切割。DNase I早從牛中分離而來，至今哺乳動物也是該酶的主要的來源之一。

單位定義：

25℃，pH5.0條件下DNase催化底物DNA，使每毫升每分鐘ΔA260增加0.001的變化定義為一個酶活力單位（Kunitz unit）。

失活抑制：

加入EDTA至終濃度為2.5mM后，65℃加熱10min可使DNase Ⅰ失活。酚氯仿抽提也可以使DNase I失活。金屬離子螯合劑，達到毫摩爾/升濃度的鋅離子，0.1%的SDS，DTT、巰基乙醇等還原劑，50～100mM以上鹽濃度均對DNase Ⅰ有顯著抑制作用。

使用方法：

一、應用于蛋白提取實驗

反應體系：蛋白提取液中按照1/100體積加入DNase I儲存液（使其終濃度為20U/mL），1/100體積加入1M MgCl2。

反應條件：37℃，30～60min。繼續后續蛋白提取實驗即可。

注：由于EDTA能螯合酶活性需要的Ca2+和Mg2+，蛋白初始裂解液中要去除EDTA，否則會降低DNase I的消化能力。
實驗步驟：
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻  
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)
操作步驟:
1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。
b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。
c．細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。
2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。
3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。
5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。
6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。
7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。
8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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