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近年來對RNA干擾和調節性小RNA的廣泛研究迫切需要一種能有效提取15?-30核苷酸左右大小RNA（包括siRNA和miRNA）的試劑盒。但是傳統的RNA提取方法如硅膠膜不能有效吸附回收，酚/胍抽提和乙醇沉淀并不能有效沉淀回收微小分子RNA，對于血液樣本更是由于其自身特點更難提取。本試劑盒的出現很好的解決了這一問題。

產品組分：

Lysis buffer———————50ml

70%乙醇——————————9ml

Wash Solution 1——————12ml

Wash Solution 2/3—————10ml

RNase-free H2O——————10ml

吸附柱和收集———————50套

microRNA吸附柱和收集管——50套

產品特點：

1.離心吸附柱內硅基質膜全部采用進口世界著名公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復性好。克服了國產試劑盒膜質量不穩定的弊端。

2.也不需要乙醇沉淀等容易喪失微小分子RNA的步驟。

3.獨特的裂解液配方，可直接裂解全血，不需要先裂解去除紅細胞。

4.多次柱漂洗確保高純度，OD260/OD280典型的比值達1.9～2.0，基本無DNA殘留,可用于RNAi，RT-PCR，Northern-blot和各種實驗。

注意事項：

1. 次使用前請先在70%乙醇、Wash Solution 1瓶和Wash Solution 2/3瓶中加入量乙醇，加入后請及時打鉤標記已加入乙醇，以免多次加入!

2. 所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可以達到13000rpm 的傳統臺式離心機，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機。

3. 需要自備乙醇，氯仿，一次性注射器，研缽。

4. Lysis buffer 和Wash Solution 1含有刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。

5. 預防RNase 污染，應注意以下幾方面：

1) 經常更換新手套。因為皮膚經常帶有細菌，可能導致RNase 污染。

2) 使用無RNase 的塑料制品和槍頭避免交叉污染。

3) RNA 在裂解液中時不會被RNase 降解。但提取后繼續處理過程中應使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小時，塑料器皿可在0.5M NaOH 中浸泡10 分鐘，然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase。

4) 配制溶液應使用無RNase 的水。（將水加入到干凈的玻璃瓶中，加入DEPC至終濃度0.1%( v/v)，37℃放置過夜，高壓滅菌。）

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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