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本試劑盒適用于快速提取植物microRNA或者microRNA/總RNA分別提取。采用分提取操作步驟也可單獨純化富集后的microRNA組分和總RNA（＞200 nt）從而得到分離富集的microRNA和RNA。試劑盒采用獨特的裂解液迅速裂解細胞和滅活細胞RNA酶，植物RNA助提劑幫助結合多糖多酚并通過離心去除，然后裂解混合物通過基因組DNA清除柱，基因組DNA被清除而RNA（包括microRNA）被選擇性濾過。濾過的RNA用乙醇調節結合條件后，RNA在高離序鹽狀態下選擇性吸附于離心柱內硅基質膜，再通過一系列特殊漂洗液快速的漂洗－離心的步驟,將細胞代謝物，蛋白等雜質去除，后低鹽的RNase free H20將純凈RNA（包括microRNA）從硅基質膜上洗脫。

傳統的microRNA提取試劑盒均是采用異硫氰酸胍//氯仿（TRIzol法）加高濃度乙醇硅膠膜吸附小片段microRNA的原理方法制成，但是復雜的植物品類如棉花、葡萄、胡楊、冬青、月季、石斛、單參、水稻種子、人參、玉米胚芽等大量樣品用TRIzol的原理甚至無法提取符合要求的總RNA，更不用說microRNA。世界著名公司采用Trizol法原理的microRNA提取試劑盒面臨復雜植物樣品時束手無策，產品線中干脆就沒有復雜植物microRNA提取試劑盒。用戶無奈只好用傳統方法，或者TRIzol法提取，用異丙醇/乙醇沉淀方法來提取microRNA，雖然也能提取到部分microRNA，但是沉淀法損失巨大或者和雜質共沉淀，影響實驗結果，在國際刊物投稿時常常面臨質疑，甚至論文被撤銷。而本試劑盒在公司數百種復雜植物提取的經驗基礎上（包括人參、雪蓮、棉花、胡楊、冬青等各種復雜植物），創新性的采用了不用，氯仿的技術路線全球家解決該問題，可以提取絕大多數復雜植物如棉花、楊樹、冬青、月季、丹參等植物microRNA，當然本試劑盒也適用于擬南芥、水稻、小麥、煙草、水稻等各種簡單樣品。

產品組分：

專用裂解液—————————50ml

植物RNA助提劑———————5ml

Wash Solution 1——————12ml

Wash Solution 2/3—————10ml

RNase-free H2O——————10ml

基因組DNA清除柱和收集管——50套

吸附柱和收集管———————50套

產品特點：

1. 完全不使用有毒的，氯仿等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。

2. 快速，簡捷，單個樣品操作一般可在30分鐘內完成。

3. 獨特的植物RNA助提劑可以有效結合多糖多酚,提高清除效果。

4. 多次柱漂洗確保高純度，OD260/OD280典型的比值達1.9～2.0，可用于RT-PCR，Northern-blot和各種實驗。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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