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本試劑盒用于快速從福爾馬林固定、石蠟包埋組織樣品中提取RNA包括microRNA。獨特的裂解液/蛋白酶K迅速裂解細胞釋放出RNA，然后裂解混合物通過一個基因組DNA清除柱，基因組DNA被清除而RNA穿透濾過。濾過的RNA用乙醇調節結合條件后,RNA在高離序鹽狀態下選擇性吸附于離心柱內硅基質膜，再通過一系列快速的漂洗-離心的步驟, 去蛋白液和漂洗液將細胞代謝物，蛋白等雜質去除，后低鹽的RNase free H20將純凈RNA從硅基質膜上洗脫。得到的RNA可用于反轉錄PCR、熒光定量PCR等實驗。

產品組分：

裂解液——————15ml

結合液——————25 ml

漂洗液——————10ml

蛋白酶K——————20mg（可選）

RNase-free H2O——————10ml

基因組DNA清除柱和收集管——————50套

RNA吸附柱和收集管室溫——————50套

產品特點：

1.完全不使用有毒的，氯仿等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。

2.快速，簡捷，單個樣品RNA提取操作一般可在1小時內完成。

3.試劑盒的獨特基因組清除柱和配方確保有效清除基因組DNA殘留，一般情況下得到的RNA不需要DNase消化，可直接用于反轉錄PCR、熒光定量PCR等實驗。

4.多次柱漂洗確保RNA高純度，可直接用于下游各種實驗。

注意事項：

1. 所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可以達到13000rpm的傳統臺式離心機，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機。

2. 樣品處理量絕對不要過基因組DNA清除柱和RNA吸附柱處理能力，否則造成DNA殘留或者產量降低。不同組織細胞種類RNA/DNA相差極大，例如胸腺脾臟DNA含量豐富，過5mg就會過柱子處理能力。COS細胞RNA含量豐富，過3x106細胞就會過柱子吸附能力。所以開始摸索實驗條件時，如果不清楚樣品DNA/RNA含量時寧可使用較少的樣品處理量，如不過2個10μm厚度石蠟切片。將來根據樣品試驗情況增加或者減少處理量。

3. 裂解液PKD、結合液RBC中含有刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。

4. 預防RNase 污染，應注意以下幾方面：

1) 經常更換新手套。因為皮膚經常帶有細菌，可能導致RNase 污染。

2) 使用無RNase 的塑料制品和槍頭避免交叉污染。

3) RNA提取過程中應使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小時，塑料器皿可在0.5 M NaOH 中浸泡10 分鐘，然后用水徹底清洗，再滅菌，即可去除RNase。

4) 配制溶液應使用無RNase 的水。（將水加入到干凈的玻璃瓶中，加入DEPC 至終濃度0.1%( v/v)，37℃放置過夜，高壓滅菌。）

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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