產(chǎn)品目錄

產(chǎn)品名稱	英文名稱	規(guī)格	貨號(hào)
RNA/mircoRNA/DNA/蛋白分提試劑盒	AllExtract Tissue/Cells RNA/mircoRNA/DNA/Protein Isolation Kit	50次	CS-01F96385

本試劑盒用于快速?gòu)膭?dòng)物細(xì)胞或者組織樣品中同時(shí)提取分離基因組DNA、總RNA和蛋白(如選購(gòu)microRNA吸附柱和配套溶液，還可以將同一個(gè)樣品的總RNA中的microRNA分離并提取，富集microRNA)。得到的RNA不需要DNase消化，可直接用于反轉(zhuǎn)錄PCR、熒光定量PCR等實(shí)驗(yàn)?；蚪MDNA也可以直接用于下游的Southern、酶切、PCR等各種試驗(yàn)。

本試劑盒采用獨(dú)特的裂解液迅速裂解細(xì)胞和滅活細(xì)胞RNase、DNase，然后裂解混合物通過(guò)一個(gè)基因組DNA吸附柱，基因組DNA被吸附而RNA和蛋白穿透濾過(guò)。DNA吸附柱上基因組DNA經(jīng)過(guò)一系列漂洗、離心后，洗脫得到純凈基因組DNA。濾過(guò)的RNA用乙醇調(diào)節(jié)結(jié)合條件后，RNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于RNA吸附柱上，再通過(guò)一系列快速的漂洗、離心洗脫得到純RNA。濾液經(jīng)選擇性沉淀得到蛋白。

試劑盒特點(diǎn)：

完全不使用有毒的，氯仿等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。

快速，簡(jiǎn)捷，單個(gè)樣品總RNA、基因組DNA和蛋白分離操作一般可在1小時(shí)內(nèi)完成。

獨(dú)特的吸附柱和配方確保有效清除基因組DNA殘留，一般情況下得到的RNA不需要DNase消化可直接用于反轉(zhuǎn)錄PCR、熒光定量PCR等實(shí)驗(yàn)。

多次柱漂洗確保RNA、基因組DNA高純度，可直接用于下游各種實(shí)驗(yàn)。

試劑盒組成：

組分規(guī)格

裂解液RLT Plus 50mL

Wash Solution 1 12mL

Wash Solution 2/3 10mL

RNase-free H2O 10mL

抑制物去除液IR 25mL

漂洗液WB 15mL

緩沖液APP 60mL

洗脫緩沖液EB 10mL

基因組DNA吸附柱DA和收集管 50套

RNA吸附柱RA和收集管 50套

保存：RT，有效期12個(gè)月

保存注意事項(xiàng)：

所有的溶液應(yīng)該是澄清的，如果環(huán)境溫度低時(shí)溶液可能形成沉淀，此時(shí)不應(yīng)該直接使用，可在37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復(fù)澄清。

不合適地保存于低溫（4℃或者-20℃）會(huì)造成溶液沉淀，影響使用效果，因此運(yùn)輸和儲(chǔ)存均在室溫下（15～25℃）進(jìn)行。

避免試劑長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、PH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時(shí)蓋緊蓋子。

注意事項(xiàng)：

所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13000rpm的傳統(tǒng)臺(tái)式離心機(jī)，如Eppendorf 5415C或者類似離心機(jī)。

樣品處理量絕對(duì)不要過(guò)基因組吸附柱DA和和RNA吸附柱RA處理能力，否則造成DNA殘留或者產(chǎn)量降低。不同組織細(xì)胞種類RNA/DNA相差極大，例如胸腺脾臟DNA含量豐富，過(guò)5mg就會(huì)過(guò)柱子處理能力。COS細(xì)胞RNA含量豐富，過(guò)3×106細(xì)胞就會(huì)過(guò)柱子吸附能力。所以開(kāi)始摸索實(shí)驗(yàn)條件時(shí)，如果不清楚樣品DNA/RNA含量時(shí)寧可使用較少的樣品處理量，如細(xì)胞不過(guò)3～4×106，組織不過(guò)10mg。將來(lái)根據(jù)樣品試驗(yàn)情況增加或者減少處理量。

裂解液RLT Plus、抑制物去除液IR、Wash solution 1、Wash solution 2/3中含有刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。

該試劑盒如需要用于植物樣品尤其是多糖多酚次級(jí)代謝產(chǎn)物豐富的困難樣品的DNA、RNA提取，請(qǐng)咨詢我司技術(shù)人員，可能需要用到其它試劑。

額外購(gòu)買microRNA吸附柱子和配套溶液，還可以將同一個(gè)樣品的總RNA和microRNA分離并提取，富集microRNA。如有需要請(qǐng)咨詢我公司。

關(guān)于DNA的微量殘留：

一般說(shuō)來(lái)任何總RNA提取試劑在提取過(guò)程中無(wú)法完全避免DNA的微量殘留（DNase消化也無(wú)法做到100%無(wú)殘留），本公司的AllExtract組織細(xì)胞RNA/DNA/蛋白分提試劑盒，由于采取了本公司獨(dú)特的緩沖體系和基因組DNA分離清除技術(shù)，絕大多數(shù)DNA已經(jīng)被清除，不需要DNase消化，可直接用于反轉(zhuǎn)錄PCR和熒光定量PCR。個(gè)別特殊情況如DNA含量過(guò)于豐富造成殘留或者要進(jìn)行嚴(yán)格的mRNA表達(dá)量分析熒光定量PCR，我們建議在進(jìn)行模板和引物的選擇時(shí)：

選用跨內(nèi)含子的引物，以穿過(guò)mRNA中的連接區(qū)，這樣DNA就不能作為模板參與擴(kuò)增反應(yīng)。

選擇基因組DNA和cDNA上擴(kuò)增的產(chǎn)物大小不一樣的引物對(duì)。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量

(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過(guò)TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見(jiàn)后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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