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本試劑是直接從細胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細胞時能保持RNA的完整性。加入氯仿后離心，樣品分成水樣層和有機層。RNA存在于水樣層中。收集上面的的水樣層后，RNA可以通過異丙醇沉淀來還原。在除去水樣層后，樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉淀的方式還原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA，在有機層中加入異丙醇能沉淀出蛋白。共純化DNA對于樣品間標準化RNA的產量十分有用。

無論是人、動物、植物還是細菌組織，該方法對少量的組織(50-100mg)和細胞(5×106)以及大量的組織(≥1g)和細胞(>107)均有較好的分離效果。本試劑操作上的簡單性允許同時處理多個的樣品。所有的操作可以在一小時內完成。本試劑抽提的總RNA能夠避免DNA和蛋白的污染。故而能夠作RNA印跡分析、斑點雜交、poly(A)+選擇、體外翻譯、RNA酶保護分析和分子克隆。如果是用于PCR，當兩條引物位于單一外顯子內時，建議用擴增級的DNase I來處理抽提的總RNA。

本試劑能促進不同種屬不同分子量大小的多種RNA的析出。例如，從大鼠抽提的RNA瓊脂糖凝膠電泳并用溴化乙啶染色，可見許多介于7 kb和15 kb之間不連續的高分子量條帶(mRNA和hnRNA成分)，兩條優勢核糖體~5 kb (28S)和~2 kb(18S)，低分子量RNA介于0.1和0.3 kb之間 (tRNA, 5S)。當抽提的RNA用TE稀釋時其A260/A280比值≥1.8。

儲存條件：室溫，有效期12個月。

注意事項：

1. 當本試劑用量少于2ml時建議使用清潔的一次性的聚丙材質試管。

2. 當本試劑用量較大時，可以使用玻璃試管(Corex)或聚丙材質試管，事先檢驗以確保該試管可以耐受加入本試劑和氯仿后12,000×g的離心力。不可使用有裂縫或者破損的試管。

3. 離心前小心平衡試管。

4. 離心前玻璃管口必須蓋上鋁箔并用石蠟膜封口，聚丙烯管必須蓋緊。

5. 從少量的組織(1~10mg)或細胞(102~104)中分離RNA 樣品：往組織或細胞中加入800μl 本試劑。待樣品裂解后，加入氯仿并進行步驟2 中的抽提操作。在用異丙醇沉淀RNA 之前，加入5~10μg 無RNA 酶的glycogen 作為水樣層的載體。為降低其黏度在加入氯仿前用26 號注射器抽吸兩次以切斷基因組DNA。Glycogen 會留在水樣層中并和RNA 共析出。在濃縮到4mg/ml 之前它不會抑制逆轉錄反應鏈的合成也不會抑制PCR。

6. 在勻化后和加入氯仿之前，樣品可以在–60～–70℃ 保存至少一個月。RNA 沉淀（步驟4，RNA 漂洗）溶于75%的乙醇在2~8℃ 至少可以保存一周，在–5~–20℃ 下至少可保存一年。

7. 臺式離心機大能達到2,600×g 的離心力，如果將離心時間延長到30~60 分鐘可以滿足步驟2 和步驟3 中的操作。

本制品別名：總RNA純化試劑|組織總RNA提取試劑|細胞總RNA提取試劑

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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