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本試劑盒本試劑盒適用于快速提取全血（液體樣本）高純度總RNA。采用改進的異硫氰酸胍/酚一步法(TRIzol法)裂解細胞和滅活RNA酶，然后總RNA在高離序鹽狀態下選擇性吸附于離心柱內硅基質膜，再通過一系列快速的漂洗-離心的步驟，去蛋白液和漂洗液將細胞代謝物、蛋白等雜質去除，后低鹽的RNase free water將純凈RNA從硅基質膜上洗脫。

產品特點：

1.離心吸附柱內硅基質膜全部采用進口世界著名公司特制吸附膜，柱與柱之間吸附量差異極小，可重復性好。克服了國產試劑盒膜質量不穩定的弊端。

2.結合了異硫氰酸胍/酚一步法試劑穩定性好，純度高和離心柱方便快捷的優點，不需要異丙醇沉淀和乙醇洗滌過程，RNA可以直接從離心柱上洗脫避免了過度干燥不易溶解問題。

3.獨特的RLS裂解液配方，可直接裂解全血，不需要先裂解去除紅細胞。

4.多次漂洗去蛋白過程，提取RNA純度更高。

5.有效的去除了5S在總RNA中含量，提高了純度。

產品組分：

組份 20次

裂解液RLS 25mL

去蛋白液RE 15mL

漂洗液RW 5mL

Rase-free H2O 10mL

70%乙醇 4mL RNase-free H2O

吸附柱 20個

收集管（2mL） 20個

注意事項：

1.次使用前請先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入量乙醇，加入后請及時打鉤標記已加入乙醇，以免多次加入!

2.所有離心步驟如未加說明，均在室溫進行。使用轉速可以達到13000rpm的傳統臺式離心機，如Eppendorf 5415C或者類似離心機。

3.裂解液RLS和去蛋白液RE中含有刺激性有害化合物，操作時要戴乳膠手套，避免沾染皮膚、眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。

4.考慮到環保問題，本試劑盒不含有實驗室常用試劑氯仿，用戶使用前需要自備氯仿。

5.常規的瓊脂糖凝膠電泳和變性膠電泳均可以用來分析RNA的質量。好的RNA產物在電泳后應該可以看到明顯的二條優勢核糖體RNA帶，分別為~5Kb（28S），~2Kb

（18S），條帶亮度比值約為2：1。有時候也可以看到~0.1kb和0.3Kb(5S，tRNA)帶。但有時候根據不同的物種如某些植物組織可以看到4，5條帶也屬于正常現象，如果RNA未成熟的前體或者不均一核RNA、小核RNA提取出來也可能看到介于7Kb和15Kb之間的不連續的高分子量條帶。

6.檢測OD260/OD280吸光度比值時，RNA樣品應該溶于TE后檢測，如果用水稀釋后檢測，由于一般水離子度和PH值低，會使OD280升高，從而使比值降低。

7.加入裂解液RLS后，加氯仿前，樣品可在–60℃～70℃保存一個月以上。

8.關于DNA的微量殘留：

一般說來任何總RNA提取試劑在提取過程中無法完全避免DNA的微量殘留，在大多數RT-PCR擴增過程中極其微量的DNA殘留（一般電泳EB染色紫外燈下觀察不可見）影響不是很大，如果要進行嚴格的mRNA表達量分析如熒光定量PCR，我們建議在進行模板和引物的選擇時：

1)選用跨內含子的引物，以穿過mRNA中的連接區，這樣DNA就不能作為模板參與擴增反應。

2)選擇基因組DNA和cDNA上擴增的產物大小不一樣的引物對。

3)將RNA提取物用RNase-free的DNase I處理。

4)在步驟去蛋白液RE漂洗前，直接在吸附柱上進行DNase I消化處理。

儲存條件：室溫，有效期12個月。(裂解液RLS需4℃避光保存)

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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