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microRNA(miRNA)和RNA干擾研究是當今分子生物學研究的一大熱點，但快速分離和純化相關的小RNA十分棘手，是目前研究miRNA的主要技術障礙之一。目前國外相關產品寥寥無幾，并且基本采用先提總RNA再富集其中的小RNA的兩步法策略，國內相關產品更是一片空白。為滿足廣大用戶的需求，開發了具有自主知識產權的本產品。

試劑盒特點：

1.從總RNA中直接分離純化小RNA，不需要使用離心吸附柱。得到的小RNA長度大部分在200nt以下，包括5S RNA、tRNA、miRNA、Pre-miRNA、pri-miRNA、siRNA、shRNA和snRNA等。

2.操作簡單快速，整個過程只需要約30分鐘。

3.小RNA純凈，OD260/280一般都在1.9以上。

4.可用于RT-PCR、miRNA標記、microarray等后續實驗。

5.此方法能去除90%左右的大RNA，但會有少量殘留大RNA，如果需要純度更高，可以選擇PAGE回收法。

儲存條件：常溫運輸，4℃保存，有效期一年。

使用方法：

1.在純化好的100μL總RNA(含大RNA和小RNA)中，加入50μL溶液A，振蕩30秒混勻。如果RNA樣品體積不足100μL，可以用RNase-free水補足，如果體積過100μL，可以用本公司核酸濃縮劑濃縮到100μL。

2.室溫12000～15000g離心30分鐘。小RNA在上清中，大RNA在沉淀中。

注意：離心時間不能短于30分鐘，否則大RNA沉淀不充分。

3.小心將上清液轉移到干凈的1.5mL RNase-free塑料離心管中。留下的沉淀可以用75%乙醇洗滌后做大RNA電泳對照用。

4.在上清液中加入200μL溶液B，振蕩30秒混勻。

5.室溫12000～15000g離心10分鐘，小心棄上清。由于溶液B中有惰性的助沉劑，所以得到的小RNA沉淀肉眼可見。

6.加入1mL溶液C，震蕩數秒。

7.室溫12000～15000g離心10分鐘，小心棄上清。

8.短暫離心數秒，小心吸棄殘留液體(約50μL左右)。

9.在沉淀中(含小RNA)加入30～100μL RNase-free水，吹打溶解即得小RNA溶液。注意：不能只吹打管底部分，還需要吹打整個離心管管壁的離心面部分，因為上面也有有小RNA沉淀。

10.好先PAGE-銀染檢測小RNA純度再使用。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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