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本試劑可以抽提長達15 kb的RNA，也可以抽提microRNA等小RNA。抽提小RNA時宜-70℃沉淀過夜。抽提所得RNA無DNA和蛋白污染。一般所得RNA溶于DEPC水后的A260/280值為1.8-2.0。裂解細胞或和組織共勻漿時，本試劑可以保持樣品中RNA的完整性，即可以有效抑制RNA的降解。每一百萬細胞用本試劑抽提可得5-15μg RNA；每毫克組織用本試劑抽提可得1-10μg RNA。產量因細胞和組織不同而異。每100ml本試劑可以抽提100個六孔板中的樣品或100個50-80mg的組織樣品。抽提兩個樣品約需一小時。

本試劑抽提所得RNA可直接用于Northern，點雜交，純化mRNA，體外翻譯，RNase protection assay，cDNA克隆，以及RT-PCR；也可以用于基因表達芯片分析、高通量測序等對RNA質量要求較高的情況。

我公司的BalbZol和Trizol的成分有細微差別，實際抽提效果無任何顯著差異。

注意事項：

本制品可4℃保存，有效期一年。

需自備氯仿，異丙醇，DEPC，75%乙醇(DEPC水配制)，和DEPC水。DEPC水(YT528)可向訂購。

所有離心管，槍頭及相關溶液都必須無RNA酶污染。耐高溫器物可150℃烘烤4小時以去除RNA酶，其它器物去除RNA酶可考慮用0.01%的DEPC水浸泡過夜，然后滅菌，烘干。溶液需用DEPC水配制。加0.01%(體積比) diethylpyrocarbonate(DEPC)至重蒸水或Milli-Q級水中，處理過夜，滅菌即成DEPC水。

使用凍存的細胞或組織抽提總RNA的效果通常比新鮮的細胞或組織差一些。因為在細胞或組織凍融過程中一些細胞或組織內的RNase會被釋放出來并剪切樣品。如果不能及時抽提RNA，推薦先加入適量本試劑，并裂解樣品后凍存。

必須戴一次性手套操作，且盡量不要對著RNA樣品呼氣或說話，以防RNA酶污染。建議戴一次性口罩操作。

本試劑含有毒物質，避免接觸皮膚或吸入。為防止濺入眼睛，請戴防護眼鏡或使用透明保護屏。如皮膚接觸本試劑，請立即用大量去垢劑和水沖洗，如仍有不適，請聽取醫生意見。

本試劑抽提總RNA的同時，理論上也可抽提蛋白和DNA，但未經測試。有興趣者可按Invitrogen公司的TRIzol的操作步驟進行操作。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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