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本試劑盒采用可以特異性結(jié)合病毒RNA的吸附柱和獨(dú)特的緩沖液系統(tǒng)，適用于從血清、血漿、尿液、腦脊液等無細(xì)胞體液及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分離病毒RNA。病毒RNA特異性地結(jié)合到硅基質(zhì)膜上，而污染物則流過該膜。通過兩次高效洗滌完全去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，然后用無RNase的水或試劑盒提供的RNase-Free Water洗脫高純度的病毒RNA。由本試劑盒提取的病毒RNA可直接用于RT-PCR、Real-time RT-PCR和印跡分析等實(shí)驗(yàn)。

自備試劑：無水乙醇，0.9% NaCl。

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備及重要注意事項(xiàng)：

1、向蛋白酶K 中加入1.25ml 蛋白酶K 儲存液使其溶解，-20℃保存。配制好的蛋白酶K 勿長時(shí)間室溫放置，避免反復(fù)凍融，以免影響其活性。

2、預(yù)防RNase污染，應(yīng)注意以下幾方面：

1)使用無RNase的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。

2)玻璃器皿應(yīng)在使用前于180℃高溫下干烤4小時(shí)，塑料器皿可在0.5M的NaOH中浸泡10分鐘，用水徹底沖洗后高壓滅菌。

3)配制溶液應(yīng)使用無RNase的水。

4)操作人員戴一次性口罩和手套，實(shí)驗(yàn)過程中要勤換手套。

3、血清或血漿避免反復(fù)凍融導(dǎo)致蛋白變性或產(chǎn)生沉淀，減少病毒滴度進(jìn)而影響提取病毒核酸的產(chǎn)量。

4、次使用前應(yīng)按照試劑瓶標(biāo)簽的說明先在Buffer RW2中加入無水乙醇。

5、Buffer GL如果產(chǎn)生沉淀，可在56℃加熱使其溶解后室溫放置。

6、所有離心步驟若無特殊說明均在室溫下進(jìn)行，且所有操作步驟動(dòng)作要迅速。

實(shí)驗(yàn)步驟：

(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測RNA的質(zhì)量

(在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理。樣品體積不應(yīng)超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養(yǎng)細(xì)胞直接在培養(yǎng)板中加入TRIzol裂解細(xì)胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養(yǎng)板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)板面積而定，不取決于細(xì)胞數(shù)。TRIzol加量不足可能導(dǎo)致提取的RNA有DNA污染。

c．細(xì)胞懸液離心收集細(xì)胞，每5-10×106動(dòng)物、植物、酵母細(xì)胞或1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1ml TRIzol，反復(fù)吸打。加TRIzol之前不要洗滌細(xì)胞以免mRNA降解。一些酵母和細(xì)菌細(xì)胞需用勻漿儀處理。

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或胞外物質(zhì)（肌肉，植物結(jié)節(jié)部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細(xì)胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時(shí)，上層有大量油脂應(yīng)去除。取澄清的勻漿液進(jìn)行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機(jī)相，上層為無色水相和一個(gè)中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉(zhuǎn)移到新管中，如要分離DNA和蛋白質(zhì)可保留有機(jī)相，進(jìn)一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側(cè)和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。移去上清。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司

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