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本試劑盒專用于從各種動物組織、植物組織、細胞、血清、血漿等樣本中分離純化miRNA，還可以提取siRNA，snRNA等其他小于200nt的小分子RNA，同時也可用于總RNA的提取。本品將酚/胍裂解技術和硅基質膜純化技術相結合，獨特的裂解液在有效抑制RNases的同時，可以通過有機抽提的方法除去細胞或組織樣品中的大部分DNA和蛋白。對于一些敏感的下游實驗中，如需富集miRNA可適用該試劑盒單獨對miRNA進行富集。本品適用樣本范圍廣，制備的RNA純度高，可直接用于敏感的下游應用，如Northern Blot分析，Real-Time PCR，Microarray Analysis等。

保存條件：TRIzon Reagent 2～8℃避光保存，其它組分室溫(15～30℃)。

自備試劑：氯仿、無水乙醇(新開封或提取RNA專用)。

實驗前準備及重要注意事項：

1、預防RNase污染，應注意以下幾方面：

1)使用無RNase的塑料制品和槍頭，避免交叉污染。

2)玻璃器皿應在使用前于180℃高溫下干烤4小時，塑料器皿可在0.5 M的NaOH中浸泡10分鐘，用水徹底沖洗后高壓滅菌。

3)配制溶液應使用無RNase的水。

4)操作人員戴一次性口罩和手套，實驗過程中要勤換手套。

2、提取的樣品避免反復凍融，否則影響miRNA提取的量和質量。

3、次使用前應按照試劑瓶標簽說明在Buffer RWT和Buffer RW2中加入無水乙醇。

4、所有離心步驟若無特殊說明均在室溫下進行，且所有操作步驟動作要迅速。

實驗步驟：

(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀

(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

操作步驟:

1. 勻漿處理:a.組織將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

b.單層培養細胞直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

c．細胞懸液離心收集細胞，每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。

2．將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。

3．可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可于2-8℃10000×g離心10分鐘，取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml，劇烈振蕩15秒，室溫放置3分鐘。

6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60℅。

7. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘。

8. 2-8℃10000×g離心10分鐘，離心前看不出RNA沉淀，離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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