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產品名稱 | 檢測方法 | 規格 | 貨號 |
桑葚超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)試劑盒 | 微量法 | 100管/96樣 | CS-01S63819 |
注意:正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
SOD(EC
測定原理:
通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統產生超氧陰離子(O2-.),O2-.可還原氮藍四唑生成藍色甲臜,后者在560nm處有吸收;SOD可清除O2-.,從而抑制了甲臜的形成;反應液藍色越深,說明SOD活性愈低,反之活性越高。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水
試劑的組成和配制:
試劑一: 5mL×1瓶,4℃保存;
試劑二:粉劑×3瓶,4℃保存,用時每支加4mL蒸餾水,充分混勻,現配現用;(該試劑為過飽和試劑,充分混勻后仍出現顆粒物不溶物不影響使用)
試劑三:液體200μL×1支,4℃保存;
試劑四:液體4mL×1瓶,4℃保存。
粗酶液提取:
按照組織質量(g):蒸餾水體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL蒸餾水),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
測定步驟:
1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至560nm,蒸餾水調零。
2、測定前將試劑一、二和四37℃(哺乳動物)25℃(其他物種)水浴5min以上。
3、樣本測定(在EP管或96孔板中依次加入下列試劑)
注意事項:
1、試劑三為酶,不可冷凍,使用時在冰上放置。
2、對照管只需要做一管。
3、若對照管吸光值大于1,建議將試劑三用蒸餾水稀釋7倍后使用(10μL試劑三原液+60μL蒸餾水)。
4、SOD為什么有的樣本測定管大于對照管,對照管數值在什么范圍?
對照管的范圍是0.4-1。對照管吸光值過低可能是(1)試劑二或試劑三沒有現配現用;(2)沒有按順序加試劑;(3)反應時間不夠,可以延長反應時間(反應時間30min可以延長到40min)。對照管吸光值過高可能是試劑三未按操作說明書稀釋相應倍數。
若出現測定管大于對照管,可能是樣本中雜質的影響太大,為了降低雜質的影響一般將樣本提取上清液用蒸餾水或提取液稀釋10倍后再測,通常可以使測定正常。計算公式中乘以相應稀釋倍數。
SOD活性計算:
1、抑制百分率的計算
抑制百分率=(A對照管-A測定管) ÷A對照管× 100%
盡量使樣本的抑制百分率在10-90%范圍內。如果計算出來的抑制百分率小于10%或大于90%,則通常需要調整加樣量后重新測定。如果測定出來的抑制百分率偏高,則需將樣本用蒸餾水適當稀釋;如果測定出來的抑制百分率偏低,則需重新準備濃度比較高的待測樣本。
2、SOD酶活性單位:在上述黃嘌呤氧化酶藕聯反應體系中抑制百分率為50%時,反應體系中的SOD酶活力定義為一個酶活力單位(U/mL)。
3、SOD酶活性計算:
a.按樣本蛋白濃度計算
SOD活性(U/mg prot)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反總]÷(V樣×Cpr)×樣本稀釋倍數=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率)÷Cpr×樣本稀釋倍數
需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒。
b.按樣本鮮重計算
SOD活性(U/g 鮮重)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反總]÷(W ×V樣÷V樣總)×樣本稀釋倍數=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率)÷W×樣本稀釋倍數
V反總:反應體系總體積,0.2mL;V樣:加入反應體系中樣本體積,0.018mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL ;W:樣本質量,g.
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原創作者:上海莼試生物技術有限公司
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