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產品名稱 | 檢測方法 | 規格 | 貨號 |
游離脂肪酸(FFA)含量試劑盒(測血清、動物組織、微生物、細胞) | 微量法 | 100管/96樣 | CS-01S63691 |
注意:正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
游離脂肪酸,也稱為非酯化脂肪酸,在與白蛋白結合的血漿中循環。動物血液中的游離脂肪酸 (FFA )含量是一項重要的生理生化指標。血清中游離脂肪酸的濃度與脂類代謝、糖代謝、內分泌功能有關,游離脂肪酸的濃度會因為糖尿病、重癥肝障礙、甲狀腺功能亢進等疾病而上升。
測定原理:
用有機溶劑萃取FFA。含有FFA的有機液與三乙醇胺銅反應,在有機相中形成脂肪酸銅 (銅皂) FFA一Cu。Cu離子與顯色液反應形成紫紅色絡合物。反應形成的顏色深淺與Cu離子濃度的關系符合朗伯一比爾定律,因此可利用此反應進行比色。
自備的儀器和用品:
酶標儀、離心機、可調式移液器、96孔板、蒸餾水。
試劑的組成和配制:
萃取液:液體 120 mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體 15 mL×1瓶,4℃保存;
試劑二:液體 15 mL×1瓶,4℃保存;
試劑三:粉劑×1瓶,室溫保存;
試劑四:液體 12 mL×1瓶,4℃保存;
樣本前處理:
1.動物組織:按照動物組織質量(g):萃取液mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL萃取液),進行冰浴勻漿。震蕩提取15min,5000 rpm 4℃離心5min,取有機相待測。
2.血清:吸取50 μL血清樣本,加入1 mL萃取液,震蕩提取15 min后,4℃,5000 rpm離心5 min,取有機相待測。
3.微生物、細胞:按照細胞數量(104個):萃取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1 mL萃取液)加入萃取液,冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲2秒,間隔3秒,總時間3min);震蕩提取15 min,然后5000 rpm 4℃離心5min,取有機相待測。
注意:有機相待測液可能存在于上層,也可能存在于下層,注意觀察,體積較多的那一層即為有機相待測液。
測定步驟:
1、酶標儀預熱30min以上,調節波長至550 nm。
2、工作液的配制:臨用前根據用量按照試劑一(V):試劑二(V):試劑三(m)=1(mL):1(mL):0.66(g)的比例充分混勻。(注意:現用現配,用多少配多少,在空瓶中配制,試劑盒中帶有4個空瓶,先將試劑一與試劑二混合,最后再加入試劑三粉劑)
3、測定管:吸取600μL樣本,加入200μL工作液,蓋緊后震蕩20 min,4℃,5000 rpm離心5 min,分層后取200μL上層有機相,加入100μL試劑四,搖勻,10 min后測定550 nm的吸光值,記為A測定。
4、空白管:吸取600μL萃取液,加入200μL工作液,蓋緊后震蕩20 min,4℃,5000 rpm離心5 min,分層后取200μL上層有機相,加入100μL試劑四,搖勻,10 min后測定550 nm的吸光值,記為A空白。
空白管只需測一次?!?/span>A=A測定-A空白
注意:1、有機溶劑易揮發,加入96孔板后應盡快檢測。
2、測定管中加入的樣本即樣本前處理中的有機相待測液。
FFA含量計算:
標準曲線:y = 0.0161x - 0.0141 R2 = 0.9985 x:棕櫚酸標準品濃度(nmol/mL)
y:吸光值差值△A
1、血清FFA含量計算:
FFA含量(μmol/mL)=(△A+0.0141)÷0.0161×V1÷(V3×V1÷V2)÷1000
=1.242×(△A+0.0141)
2、動物組織、微生物、細胞中FFA含量計算:
(1)按樣本蛋白濃度計算
FFA含量(μmol/g鮮重)=(△A+0.0141)÷0.0161×V1÷(W× V1÷V2)÷1000
=0.062×(△A+0.0141)÷W
(2)按樣本蛋白濃度計算
FFA含量(μmo/mg prot)= (△A+0.0141)÷0.0161×V1÷(V1×Cpr)÷1000
=0.062×(△A+0.0141)÷Cpr
V1:加入樣本體積,0.6mL;V2:萃取液體積,1mL;V3:加入血清(漿)體積,0.05 mL;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:動物組織樣品質量,g; 1000:1 μmol=1000 nmol 。
注意事項:
1.蛋白含量不可直接用萃取液提取的有機相待測液直接測定,可用蒸餾水或緩沖液或生理鹽水選用本公司的BCA法蛋白含量測定試劑盒。
2.最低檢出限為20 nmol/mL。
1. 本產品僅供科研使用。請勿用于醫藥、臨床診斷或治療,食品及化妝品等用途。請勿存放于普通住宅區。
2. 為了您的安全和健康,請穿好實驗服并佩戴一次性手套和口罩操作。
原創作者:上海莼試生物技術有限公司
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