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產(chǎn)品名稱 | 檢測方法 | 規(guī)格 | 貨號 |
糖原合成酶(Glycogen synthase,GCS)試劑盒 | 微量法 | 100管/96樣 | CS-01S63661 |
注意:正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
GCS(EC
測定原理:
GCS催化UDPG和葡萄糖殘基生成糖原和UDP,丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶進一步依次催化NADH氧化生成NAD+,在340nm下測定NADH下降速率,即可反映GCS活性。
需自備的儀器和用品:
分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
提取液:100mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體18 mL×1瓶, 4℃保存;
試劑二:液體2.5mL×1瓶,4℃保存;
試劑三:液體16.4uL×1支,4℃保存;
試劑四:粉劑×1支, -20℃保存;
試劑五:粉劑×1支, -20℃保存;
樣本的前處理:
按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
測定步驟:
1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至340nm,蒸餾水調(diào)零。
2、工作液的配制:臨用前將試劑三和試劑四轉移到試劑一中混合溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。
3、試劑五的配制:臨用前在試劑五中加入1mL試劑二充分溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。
4、將工作液和試劑五置于37℃預熱5分鐘。
5、在1mL微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑五和180μL工作液,立即混勻,記錄340nm處初始吸光值A1和1min后的吸光值A2,計算ΔA=A1-A2。
注意:在該試劑盒中,若ΔA大于0.1,需將樣本用提取液稀釋適當倍數(shù)后測定,使ΔA小于0.1可提高檢測靈敏度。計算公式中乘以相應稀釋倍數(shù)。
GCS活性計算:
a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下
(1)按樣本蛋白濃度計算
單位定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
GCS(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=3215×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計算
單位定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
GCS(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=3215×ΔA÷W
V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,1 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g。
b.用96孔板測定的計算公式如下
(1)按樣本蛋白濃度計算
單位定義:每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
GCS(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計算
單位定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
GCS(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=6430×ΔA÷W
V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數(shù),6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,1 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g。
1. 本產(chǎn)品僅供科研使用。請勿用于醫(yī)藥、臨床診斷或治療,食品及化妝品等用途。請勿存放于普通住宅區(qū)。
2. 為了您的安全和健康,請穿好實驗服并佩戴一次性手套和口罩操作。
原創(chuàng)作者:上海莼試生物技術有限公司
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