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標(biāo)簽:丙酮酸羧化酶（PC)試劑盒
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人增殖誘導(dǎo)配體酶聯(lián)免疫試劑盒實(shí)驗(yàn)技術(shù)
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公司上萬種科研產(chǎn)品，主要供應(yīng)各大科研單位和學(xué)校，是國內(nèi)眾多科研單位的供應(yīng)商。公司嚴(yán)把質(zhì)量關(guān)，確保每一個(gè)出廠產(chǎn)品質(zhì)量合格，讓您買的省心，用得放心。
| 產(chǎn)品名稱 | 檢測方法 | 規(guī)格 | 貨號 |
| 丙酮酸羧化酶（PC)試劑盒 | 微量法 | 100管/96樣 | CS-01Ｓ63658 |
注意：正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC，EC
測定原理：
PC催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP和Pi，蘋果酸脫氫酶進(jìn)一步催化草酰乙酸和NADH生成蘋果酸和NAD+，在340nm下測定NADH氧化速率，即可反映PC活性。
需自備的儀器和用品：
分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
提取液：100mL×1瓶，4℃保存；
試劑一：液體18 mL×1瓶， 4℃保存；
試劑二：液體13uL×1支，4℃保存；
試劑三：粉劑×1支，-20℃保存；
試劑四：粉劑×1支，-20℃保存；
樣本的前處理
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
1、稱取約0.1g組織或收集500萬細(xì)菌或細(xì)胞，加入1mL提取液，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2、將勻漿600g，4℃離心5min。
3、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。
4、上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的PC（此步可選做）。
5、在步驟④的沉淀中加入1mL提取液，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次），用于線粒體PC活性測定。
測定步驟：
1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。
工作液的配制：臨用前將試劑二和試劑三轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用；置于37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)預(yù)熱5分鐘；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
試劑四的配制：在試劑四瓶中加入1mL蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
2、在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑四和180μL工作液，立即混勻，記錄340nm處初始吸光值A1和 2min后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。
注意：在該試劑盒中，若ΔA大于0.5，需將樣本用提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后測定，使ΔA小于0.5可提高檢測靈敏度。計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
PC活性計(jì)算：
a.用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PC（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計(jì)算
單位定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PC（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=1608×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
單位定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PC（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=3.215×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。
b.用96孔板測定的計(jì)算公式如下
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PC（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計(jì)算
單位定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PC（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=3216×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
單位定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。
PC（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=6.43×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。
1. 本產(chǎn)品僅供科研使用。請勿用于醫(yī)藥、臨床診斷或治療，食品及化妝品等用途。請勿存放于普通住宅區(qū)。
2. 為了您的安全和健康，請穿好實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套和口罩操作。
原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司
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