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產品名稱 | 檢測方法 | 規格 | 貨號 |
圖 | 微量法 | 100T/96S | CS-01S63596 |
TrxR是一種NADPH依賴的包含FAD結構域的二聚體硒酶,屬于吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶家族成員,與硫氧還蛋白以及NADPH共同構成了硫氧還蛋白系統。TrxR與GR活性類似,催化GSSG還原生成GSH,是谷胱甘肽氧化還原循環關鍵酶之一。
測定原理:
TrxR催化NADPH還原DTNB生成TNB和NADP+,TNB在412 nm有特征吸收峰,通過測定412nm波長處TNB的增加速率,即可計算TrxR活性。
自備儀器和用品:
低溫離心機、可調節移液器、可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、和蒸餾水。
試劑組成和配制:
試劑一:液體120mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:液體2mL×1瓶,4℃避光保存。
試劑三:粉劑×1管,4℃保存。臨用前加入2mL蒸餾水溶解。
粗酶液提?。?/span>
1.組織:按照組織質量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿。8000g,4℃離心10min,取上清置冰上待測。
2.細菌、真菌:按照細胞數量(104個):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后8000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。
3. 血清等液體:直接測定。
TrxR測定操作:
1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min,調節波長到412nm,用蒸餾水調零。
2. 試劑一在25℃(一般物種)或者37℃(哺乳動物)預熱30min。
3. 空白管:取微量玻璃比色皿或96孔板,加入20μL試劑二,20μL試劑三,160μL試劑一,迅速混勻后于412 nm測定10 s和310 s吸光度,記為A1和A2?!?/span>A空白管=A2-A1。
4. 測定管:取微量玻璃比色皿或96孔板,加入20μL試劑二,20μL試劑三,140μL試劑一,20μL上清液,迅速混勻后于412 nm測定10 s和310 s吸光度,記為A3和A4。△A測定管=A4-A3。
注意:空白管只需測定一次。
TrxR活性計算公式:
(1). 按蛋白濃度計算
活性單位定義:在25℃或者37℃中,每毫克蛋白每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個酶活單位。
TrxR(nmol/min /mg prot)=(△A測定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總÷(Cpr×V樣)÷T
= 147×(△A測定管-△A空白管)÷Cpr
(2). 按樣本質量計算
活性單位定義:在25℃或者37℃中,每克樣本每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個酶活單位。
TrxR(nmol/min /g 鮮重)=(△A測定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T
= 147×(△A測定管-△A空白管)÷W
(3)按細胞數量計算
活性單位定義:在25℃或者37℃中,每104個細胞每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個酶活單位。
TrxR(nmol/min/104 cell)=(△A測定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T
= 147×(△A測定管-△A空白管)÷ 細胞數量
(4)按液體體積計算
活性單位定義:在25℃或者37℃中,每毫升液體每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個酶活單位。
TrxR(nmol/min /mL)=(△A測定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總÷V樣÷T
= 147×(△A測定管-△A空白管)
ε:TNB在412nm處的微摩爾消光系數,0.0136 L/μ mol/cm;d:比色皿光徑,1cm;V反總:反應體系總體積(L),200μL=2×10-4 L;Cpr:上清液蛋白質濃度(mg/mL),需要另外測定;W :樣品質量;V樣:加入反應體系中上清液體積(mL),20μL=0.02 mL;V樣總:提取液體積,1 mL;T:反應時間(min),5 min。
b.使用96孔板測定的計算公式如下
(1). 按蛋白濃度計算
活性單位定義:在25℃或者37℃中,每毫克蛋白每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個酶活單位。
TrxR(nmol/min /mg prot)=(△A測定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總÷(Cpr×V樣)÷T
= 294×(△A測定管-△A空白管)÷Cpr
(2). 按樣本質量計算
活性單位定義:在25℃或者37℃中,每克樣本每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個酶活單位。
TrxR(nmol/min /g 鮮重)=(△A測定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T
= 294×(△A測定管-△A空白管)÷W
(3)按細胞數量計算
活性單位定義:在25℃或者37℃中,每104個細胞每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個酶活單位。
TrxR(nmol/min/104 cell)=(△A測定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T
= 294×(△A測定管-△A空白管)÷ 細胞數量
(4)按液體體積計算
活性單位定義:在25℃或者37℃中,每毫升液體每分鐘催化1nmol DTNB還原為1個酶活單位。
TrxR(nmol/min /mL)=(△A測定管-△A空白管)÷ε÷d×V反總÷V樣÷T
= 294×(△A測定管-△A空白管)
ε:TNB在412nm處的微摩爾消光系數,0.0136 L/μ mol/cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V反總:反應體系總體積(L),200μL=2×10-4 L;Cpr:上清液蛋白質濃度(mg/mL),需要另外測定;W :樣品質量;V樣:加入反應體系中上清液體積(mL),20μL=0.02 mL;V樣總:提取液體積,1 mL;T:反應時間(min),5 min。
注意事項:
1.測定前須先取1~2個樣做預實驗,哺乳動物組織及血液制品TrxR活力測定時,一般須用蒸餾水稀釋5倍左右;測定過程操作須迅速。
2.試劑二和試劑三配制好后3天內使用完。
1. 本產品僅供科研使用。請勿用于醫藥、臨床診斷或治療,食品及化妝品等用途。請勿存放于普通住宅區。
2. 為了您的安全和健康,請穿好實驗服并佩戴一次性手套和口罩操作。
原創作者:上海莼試生物技術有限公司
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