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| 產品名稱 | 檢測方法 | 規格 | 貨號 |
| 苯胺-4-羥化酶（AH）試劑盒 | 分光光度法 | 50管/24樣 | CS-01Ｓ63214 |
細胞色素P450酶是一組主要存在于肝臟的同工酶，在外源物質代謝中具有重要作用，尤其是藥物和毒物的代謝。AH在P450酶系中相當于CYP2E1亞型，CYP2E1不僅參與了藥物的代謝，而且還能催化多種前致癌物和前毒物的活化過程。
測定原理：
AH催化苯胺羥化后產生的4-氨基酚，進一步轉變為酚-吲哚復合物，在630nm處有特征吸收峰；通過測定630nm吸光度增加速率，來計算AH活性。
自備儀器及用品：
可見分光光度計、普通離心機、超速離心機、可調式移液槍、1mL玻璃比色皿、雙蒸水和冰。
試劑組成和配制：
試劑一：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入50 mL蒸餾水，充分溶解。
試劑二：液體×1瓶，4℃保存。
試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入26 mL蒸餾水，充分溶解。
試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入13 mL蒸餾水，充分溶解。
試劑五：液體×1瓶，4℃保存。
試劑六：粉劑×1瓶（腐蝕性試劑），4℃避光保存。臨用前加入26 mL蒸餾水，充分溶解。
試劑七：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入26 mL蒸餾水充分溶解。
標準液：液體×1瓶，10μmol/L，4℃避光保存。
粗酶液提取：
1、除去細胞核，線粒體等大分子物質：稱約0.5g組織，加入1mL試劑一，冰上充分研磨，10 000g 4℃，離心30min，取上清液，轉移到超速離心管中。
2、粗制微粒體： 100 000g 4℃，離心60min，棄上清液。
3、除血紅蛋白等雜質：向步驟2的沉淀中加1mL試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g離心30min，棄上清液。
4、最終微粒體：向步驟3的沉淀中加試劑二0.5mL，蓋緊后充分震蕩溶解，即粗酶液，待測。
測定操作：
1. 分光光度計預熱30 min，調節波長到630 nm，蒸餾水調零。
2. 試劑三置于37℃水浴中預熱30min。
3. 試劑五置于冰浴預冷30min。
4. 標準管：取1.5 mL EP管，加入500μL 標準液，500μL試劑六，500μL試劑七，混勻后室溫靜置30min，于630 nm測定光吸收，記為A標準管。
5. 對照管：取1支1.5 mL EP管，加入250μL粗酶液，500μL試劑三，250μL蒸餾水，混勻后37℃水浴中保溫30min；再加入500μL試劑五，混勻后冰浴5min，11000rpm，4℃，離心10min；取500μL上清液，加入1支新的1.5 mL EP管；再加入500μL試劑六，500μL試劑七，混勻后室溫靜置30min，于630 nm測定光吸收，記為A對照管。
6. 測定管：取1支1.5 mL EP管，加入250μL粗酶液，500μL試劑三，250μL試劑四，混勻后37℃水浴中保溫30min；再加入500μL試劑五，混勻后冰浴5min，11000rpm，4℃，離心10min；取500μL上清液，加入1支新的1.5 mL EP管；再加入500μL試劑六，500μL試劑七，混勻后室溫靜置30min，于630 nm測定光吸收，記為A測定管。
AH活性計算公式：
(1)按照蛋白濃度計算:
活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘催化產生1nmol 4-氨基酚為1個酶活單位。
AH活性(nmol/min/mg prot) = C標準品×V標準品×（A測定管－A對照管）÷A標準管×稀釋倍數÷（Cpr×V樣）÷T
= 2×（A測定管－A對照管）÷A標準管÷Cpr
(2)按照樣本質量計算:
活性單位定義：37℃中每克樣本每分鐘催化產生1nmol 4-氨基酚為1個酶活單位。
AH活性(nmol/min/g 鮮重)= C標準品×V標準品×（A測定管－A對照管）÷A標準管×稀釋倍數÷(W×V樣)÷T
= 2×（A測定管－A對照管）÷A標準管÷W
C標準品：10μmol/L；V標準品：500μL=0.0005L；稀釋倍數：V反總÷V上清液=1500μL÷500μL=3；Cpr：粗酶液蛋白質濃度，mg/mL，需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒；V樣：加入反應體系中粗酶液體積，250μL=0.25 mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，30min。
原創作者：上海莼試生物技術有限公司
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