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產品名稱 | 檢測方法 | 規格 | 貨號 |
氧化型谷胱甘肽含量測定試劑盒 | 分光光度法 | 50管/48樣 | CS-01S63247 |
GSH/GSSG是細胞內最重要的氧化還原對之一。因此,測定細胞內GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值,能夠很好地反映細胞所處的氧化還原狀態,也是谷胱甘肽氧化還原循環的主要指標之一。
測定原理:
利用2-VP法測GSSG含量。
自備儀器和用品:
可見分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、可調節移液器、1mL玻璃比色皿和蒸餾水。
試劑組成和配置:
試劑一:液體50mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:液體300μL×1支,4℃保存。
試劑三:液體50mL×1瓶,4℃保存。
試劑四:液體6mL×1瓶,4℃保存。
試劑五: 液體30μL×1瓶,-20℃保存。臨用前加入0.6 mL試劑三稀釋,4℃保存。
試劑六:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入40 mL試劑三溶解,現配現用。
粗酶液提取:
1. 組織:按照組織質量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清液(如上清不清澈,再離心3min)待測。
2. 細菌、真菌:按照細胞數量(104個):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);8000g 4℃離心10min,取上清液(如上清不清澈,再離心3min)的蒸餾水混勻待測。
3. 血清等液體:直接測定。
測定操作:
1. 分光光度計預熱30 min,調節波長到412 nm,蒸餾水調零。
2. 試劑三置于25℃(一般物種)或者37℃(哺乳動物)水浴中保溫30min。
3. 測定管:取1 mL EP管,加入100 μ L上清液,5μ L試劑二,蓋緊后混勻,置于37℃水浴30min;依次加入100 μ L試劑四,10 μ L試劑五,700 μ L試劑六,迅速混勻后,立即測定30 s和150 s光吸收A1和A2,計算ΔA=A2-A1。
GSSG含量計算公式:
1、標準條件下測定的回歸方程為y=0.0276x-0.0011;x為標準品濃度(nmol/mL),y為吸光值(ΔA)。
2、 按蛋白濃度計算
GSSG(nmol/mg prot)=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V樣÷(V樣×Cpr)
=36.23×(ΔA+0.0011)÷Cpr
3、按樣本鮮重計算
GSSG(nmol /g 鮮重)=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V樣÷(V樣÷V樣總×W)
=36.23×(ΔA+0.0011)÷W
4、按細胞數量計算
GSSG(nmol/104 cell)=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V樣÷(V樣÷V樣總×細胞數量)
=36.23×(ΔA+0.0011)÷細胞數量
5、按照液體體積計算
GSSG(nmol/mL)=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V樣÷V樣
=36.23×(ΔA+0.0011)
V樣:反應中加入樣本體積,0.1mL;V樣總:加入提取液體積, 1mL;W:樣品質量,g,Cpr:樣本蛋白濃度(mg/mL)
注意事項:
1.提取過程中去掉蛋白質,所以提取液不能用于測定蛋白含量。
2.臨用前配制的試劑配好后4℃保存,2天內使用完畢。
3.最低檢出限為0.1μmol/L。
4.反應溫度.嚴格來說,為保證重復性,應在25℃下進行反應。
5.反應時間需精確控制,否則會影響反應速率計算,產生較大誤差。
6.樣品中的GSSG濃度盡可能低一些,否則反應速率太大,沒法控制,所以稀釋倍數要盡量大些。
原創作者:上海莼試生物技術有限公司
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