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產品名稱 | 檢測方法 | 規格 | 貨號 |
亞硝酸還原酶(Nitrite reductase,NiR)試劑盒 | 分光光度法 | 50管/24樣 | CS-01S63232 |
硝酸還原酶(NiR)是一類能催化亞硝酸鹽還原的酶,廣泛存在于微生物及植物體內,是自然界氮循環過程中的關鍵酶,可以將亞硝酸鹽降解為NO或NH3,從而減少環境中亞硝態氮的積累,降低因亞硝酸鹽累積而造成的對生物體的毒害作用。
測定原理
亞硝酸還原酶可將NO2—還原為NO,使樣品中參與重氮化反應生成紫紅色化合物的NO2—減少,即540nm處吸光值的變化可反應亞硝酸還原酶的活性。
需自備的儀器和用品
天平、研缽、可見分光光度計、水浴鍋、低溫離心機、1mL玻璃比色皿。
試劑的組成和配制
提取液:液體80mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:液體10mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加12mL蒸餾水溶解。
試劑三:液體12mL×1瓶,4℃保存。(如出現沉淀可以70-80℃加熱溶解)
試劑四:液體25mL×1瓶,4℃避光保存。(如出現沉淀可以70-80℃加熱溶解)
試劑五:液體25mL×1瓶,4℃避光保存。
工作液:臨用前根據用量將試劑四和試劑五以1:1的比例混合。
酶液提取
1. 組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2.細菌、真菌:按照細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后10000g,4℃離心10min,取上清置于冰上待測。
測定操作表
圖
計算公式
標準曲線:y = 1.3594x + 0.0072,R2 = 0.9997;x為標準品濃度(μmol/mL),y為吸光值(A標準管-A空白管)。
1.按照蛋白含量計算
酶活單位定義:每毫克組織蛋白每小時還原1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
NiR(μmol/h /mg prot)= [A空白管-(A測定管-A對照管)-0.0072]÷1.3594×V標÷(V樣×Cpr)÷T = 1.47×(A空白管-A測定管+A對照管-0.0072)÷Cpr
2. 按照樣本質量計算
酶活單位定義:每克組織每小時還原1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
NiR(μmol/h/g 鮮重)=[A空白管-(A測定管-A對照管)-0.0072]÷1.3594×V標÷(W ×V樣÷V樣總)÷T = 1.47×(A空白管-A測定管+A對照管-0.0072)÷W
3. 按照細胞數量計算
酶活單位定義:每104個細胞每小時還原1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。
NiR(μmol/h /104 cell)= [A空白管-(A測定管-A對照管)-0.0072]÷1.3594×V標÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T = 1.47×(A空白管-A測定管+A對照管-0.0072)÷細胞數量
V標:標準液體積,0.2mL;V樣:體系中加入樣本體積,0.1mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應時間,1h; Cpr:樣本蛋白含量;W:樣本質量,g
注意事項
1.配制好的工作液3天內使用完。
2.若吸光值超過3,將上清液進行適當的稀釋后再加入工作液顯色,并在計算公式中乘以稀釋倍數。
3.嚴格控制顯色時間,否則會對結果有影響。
4.標準曲線線性范圍為0.03μmol/mL-1.5μmol/mL。
5.A空白管-(A測定管-A對照管)線性范圍為0.02-3。
原創作者:上海莼試生物技術有限公司
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