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產品名稱	檢測方法	規格	貨號
脫氫抗壞血酸還原酶（dehydroascorbate reductase，DHAR）試劑盒	分光光度法	50管/48樣	CS-01Ｓ63262

注意：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

DHAR存在于細胞質、線粒體和葉綠體中。DHAR催化GSH還原DHA生成AsA和GSSG，調控細胞AsA/DHA比值，是抗壞血酸-谷胱甘肽氧化還原循環的關鍵酶。提高植物體內的 DHAR 活性，可提高植物食品中AsA含量，進而提高植物食品的營養品質。

商品介紹：

測定原理：

DHAR催化GSH還原DHA生成AsA，通過測定DHA減少速率，計算DHAR活性。

實驗中所需儀器及設備：

研缽、冰、低溫離心機、紫外分光光度計、1mL石英比色皿、可調式移液器和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體50 mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體35 mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶（棕色），4℃保存。臨用前加入5mL蒸餾水充分溶解。

試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入5mL蒸餾水充分溶解。

粗酶液提取：

1.按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。

2. 細菌、真菌：按照細胞數量（104個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；8000g 4℃離心20min，取上清液置冰上混勻待測。

3. 血清等液體：直接測定。

DHAR測定操作：

1. 分光光度計預熱30 min，調節波長到265nm，蒸餾水調零。

2. 試劑二在25℃水浴鍋中預熱30 min。

3. 在1mL石英比色皿中依次加入100μL試劑三、100μL試劑四和700μL 試劑二，最后加100μL上清液，迅速混勻后于265nm比色，記錄30s和150s的吸光值A1和A2，△A=A2-A1。

DHAR活性計算公式：

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘還原生成1nmol AsA 為1個酶活單位。

DHAR(nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V反總×109÷(Cpr×V樣)÷T

= 92×△A ÷Cpr

(2). 按樣本質量計算

活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘還原生成1nmol AsA 為1個酶活單位。

DHAR(nmol/min/g鮮重) = △A÷ε÷d×V反總×109÷(W×V樣÷V樣總)÷T

= 92×△A ÷W

(3). 按細胞數量計算

活性單位定義：25℃中每104個細胞每分鐘還原生成1nmol AsA 為1個酶活單位。

DHAR(nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V反總×109÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T

= 92×△A ÷細胞數量

（4）按液體體積計算

活性單位定義：25℃中每毫升樣本每分鐘還原生成1nmol AsA 為1個酶活單位。

DHAR(nmol/min/mL) = △A÷ε÷d×V反總×109÷V樣÷T

= 92×△A

ε?：AsA在265nm處摩爾吸光系數為5.42×104 L/mol /cm；109：摩爾分子換算成納摩爾分子；d：比色杯光徑，1 cm；V反總：反應體系總體積，1mL=0.001 L；V樣：反應體系中加入上清液體積，100μL =0.1mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；W，樣本質量，g；T：反應時間，2 min。

注意事項：

臨用前配制的試劑未使用完的4℃保存，3天內使用完。

注意：

1. 本產品僅供科研使用。請勿用于醫藥、臨床診斷或治療，食品及化妝品等用途。請勿存放于普通住宅區。
2. 為了您的安全和健康，請穿好實驗服并佩戴一次性手套和口罩操作。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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