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產(chǎn)品名稱	檢測方法	規(guī)格	貨號
4-香豆酸：輔酶A連接酶（?4-coumarate:CoA ligase，4CL)試劑盒	分光光度法	50管/24樣	CS-01Ｓ63280

注意：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

4CL是連接苯丙酸途徑與木質素特異合成途徑的關鍵酶，主要催化肉桂酸生成相應的肉桂酸輔酶A酯，是合成木質素與其他苯丙烷類化合物的代謝流向調(diào)控點。該酶主要存在于高等植物、酵母和菌類中，研究該酶可以探討多種生物細胞發(fā)育過程中木質素沉積的代謝機理，為減少水果石細胞含量而提高其品質提供依據(jù)。

商品介紹：

測定原理：

4CL催化4-香豆酸和CoA生成4-香豆酸CoA，在333nm下測4-香豆酸CoA生成速率，即可反映4CL活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：60mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體60 mL×1瓶， 4℃保存；

試劑二：粉劑×2瓶，-20℃保存；

粗酶液提取：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計40℃預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至333nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

（1）在試劑二中加入12.5mL試劑一充分溶解混勻，置于40℃水浴預熱10min；現(xiàn)配現(xiàn)用（配好后24h內(nèi)用完）；

（2）測定管：在1mL石英比色皿中加入50μL樣本和950μL試劑二，混勻，立即記錄333nm處40℃反應30min后的吸光值A2。

對照管：在1mL石英比色皿中加入50μL樣本和950μL試劑一，混勻，立即記錄333nm處40℃反應30min后的吸光值A1，計算ΔA=A2-A1。

注意：每個測定管設一個對照管。

4CL活性計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol4-香豆酸輔酶A定義為一個酶活力單位。

4CL（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=31.75×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位定義：每g組織每分鐘生成1 nmol 4-香豆酸輔酶A定義為一個酶活力單位。

4CL（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=31.75×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol 4-香豆酸輔酶A定義為一個酶活力單位。

4CL（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.063×ΔA

V反總：反應體系總體積，1×10-3 L；ε：4-香豆酸輔酶A摩爾消光系數(shù)，2.1×104 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.05 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，30 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。

注意：

1. 本產(chǎn)品僅供科研使用。請勿用于醫(yī)藥、臨床診斷或治療，食品及化妝品等用途。請勿存放于普通住宅區(qū)。
2. 為了您的安全和健康，請穿好實驗服并佩戴一次性手套和口罩操作。

原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術有限公司

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4、訂貨時間為工作日每周一至周五16:00之前。

5、如需代為檢測，標本對環(huán)境溫度高，可聯(lián)系客服安排專人取樣（限省內(nèi)客戶）。

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