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標(biāo)簽:磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK)試劑盒
聯(lián)系人:高小姐
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| 產(chǎn)品名稱 | 檢測方法 | 規(guī)格 | 貨號 |
| 磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK)試劑盒 | 分光光度法 | 50管/48樣 | CS-01Ｓ63304 |
PEPCK（EC
測定原理：
PEPCK催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和CO2，丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶進(jìn)一步依次催化NADH氧化生成NAD+，在340nm下測定NADH下降速率，即可反映PEPCK活性。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1 mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
提取液：60mL×1瓶，4℃保存；
試劑一：液體45 mL×1瓶， 4℃保存；
試劑二：液體41μL×1支，4℃保存；
試劑三：粉劑×1支， -20℃保存；
試劑四：粉劑×1支，-20℃保存；
樣本的前處理：
1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
3、血清（漿）樣品：直接檢測。
測定步驟：
1、分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、工作液的配制：臨用前將試劑二和試劑三轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
3、試劑四的配制：臨用前加入2.5mL蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
4、將工作液和試劑四置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)預(yù)熱5分鐘。
5、在1mL石英比色皿中加入50μL樣本、50μL試劑四和900μL工作液，立即混勻，記錄340nm處初始吸光值A1和 1min后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2。
注意：在該試劑盒中，若ΔA大于0.1，需將樣本用提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后測定，使ΔA小于0.1可提高檢測靈敏度。計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
PEPCK活性計算：
1、血清（漿）PEPCK活力計算
單位定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
PEPCK（nmol/min/mL））＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷V樣÷T=3215×ΔA
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中PEPCK活力計算
（1）按樣本蛋白濃度計算
單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。
PEPCK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=3215×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算
單位定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
PEPCK（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=3215×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：
單位定義：每1萬個細(xì)胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
PEPCK（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=6.43×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，1×10-3 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.05 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。
原創(chuàng)作者：上海莼試生物技術(shù)有限公司
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