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產品名稱 | 檢測方法 | 規格 | 貨號 |
脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)活性試劑盒 | 分光光度法 | 25管/24樣 | CS-01S63344 |
FAS是脂肪酸合成關鍵酶,催化乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A而生成長鏈脂肪酸。FAS普遍表達于各種組織細胞中,在哺乳動物肝、腎、腦、肺和乳腺以及脂肪組織中表達豐富。
測定原理:
FAS催化乙酰CoA、丙二酰CoA和NADPH生成長鏈脂肪酸和NADP+;NADPH在340nm有吸收峰,而NADP+沒有;通過測定340nm 光吸收下降速率,計算FAS活性。
自備儀器和用品:
研缽、冰、臺式離心機、紫外分光光度計、1mL石英比色皿、可調式移液槍和蒸餾水。
試劑組成和配制:
試劑一:液體25mL×1瓶,-20℃保存。用前1 d取出置于4℃充分解凍后混勻。
試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入550 μL試劑四,充分溶解,用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。
試劑三:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入550 μL試劑四,充分溶解,用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。
試劑四:液體25mL×1瓶,4℃保存。
試劑五:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加入1050 μL試劑四,充分溶解,用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融。
粗酶液提?。?/span>
1.組織:按照組織質量(g):試劑一體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL試劑一)進行冰浴勻漿。12000g,4℃離心40min,取上清置冰上待測。
2.細菌、真菌:按照細胞數量(104個):試劑一體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL試劑一),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后12000g,4℃,離心40min,取上清置于冰上待測。
3.血清等液體:直接測定。
FAS測定操作:
1. 分光光度計預熱30min,調節波長到340 nm,蒸餾水調零。
2. 試劑四置于40℃水浴中預熱30 min。
3. 測定管:在1mL石英比色皿中依次加入100μL上清液、20μL試劑二、20μL試劑三、820μL試劑四和40μL試劑五,迅速混勻后于340nm處測定吸光值,記錄第30s和90s時吸光值,分別記錄為A1和A2。△A測=A1-A2。
FAS活性計算公式:
(1)按照蛋白濃度計算
活性單位定義:37℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個酶活單位。
FAS(nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(Cpr×V樣)÷T
=1608×△A÷Cpr
(2)按照樣本質量計算
活性單位定義:37℃中每克組織每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個酶活單位。
FAS(nmol/min/g 鮮重) = (△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(W×V樣÷V樣總)÷T
=1608×△A ÷W
(3)按細胞數量計算
活性單位定義:37℃中每104個細胞每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個酶活單位。
FAS(nmol /min/104cell) = (△A÷ε÷d×V反總×109) ÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T
=1608×△A ÷細胞數量
(4)按液體體積計算
活性單位定義:37℃中每毫升樣本每分鐘氧化1nmol NADPH 為1個酶活單位。
FAS(nmol /min/mL) =(△A÷ε÷d×V反總×109) ÷V樣÷T
=1608×△A
ε:NADPH摩爾消光系數,6.22×103/mol/cm;d:比色皿光徑,1 cm;V反總:反應體系總體積,1000μL=0.001 L;Cpr:上清液蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;V樣:加入反應體系中上清液體積,100μL=0.1 mL;T:反應時間,1min。
原創作者:上海莼試生物技術有限公司
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