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采用pH示差法測定花色苷含量，當pH為1.0時花色苷在530nm處有最大吸收峰,而當pH為4.5時,花色苷轉變為無色查爾酮形式,在530處無吸收峰, 利用此特性分別測定在不同pH下的530nm和700nm處的吸光度值。pH示差法減少了溶液pH和溶劑差異的影響，排除了其他非花色苷類物質對檢測結果的干擾。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、水浴鍋、可調式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：液體50 mL× 1瓶，4℃保存；

試劑一：液體50 mL× 1瓶，4℃保存；

試劑二：液體50 mL × 1瓶，4℃保存；

花色苷的提取：

按照烘干樣品質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g烘干樣品，加入1mL提取液），充分勻漿后轉移到EP管中，提取液定容至1 mL，蓋緊后4℃浸提24 h，8000 g，25℃離心10 min，取上清液待測。

測定步驟：

1、分光光度計預熱30min以上；試劑一和試劑二預熱10min以上。

2、取100 μL上清液和900 μL試劑一（相當于稀釋10倍），40℃水浴20min，分別測定530nm和700nm處的吸光值，分別記為A1和A2。

3、取100 μL上清液和900 μL試劑二（相當于稀釋10倍），40℃水浴20min，分別測定530nm和700nm處的吸光值，分別記為A3和A4。

4、計算△A=（A1-A2）-(A3-A4)

注意：如果A1大于1，可以適當加大稀釋倍數，保證總體積1mL不變，如50 μL上清液和950 μL試劑一（相當于稀釋20倍）；如果A1小于0.1，可以適當縮小稀釋倍數，保證總體積不變，如200 μL上清液和800 μL試劑一（相當于稀釋5倍），使A1保持在0.1~1范圍內，可提高檢測靈敏度；同樣調整上清液和試劑二體積比例；計算時以實際稀釋倍數代入下述公式中。

花色苷含量計算：

花色苷含量（μg/g干重）=[ΔA×V÷（ε×d）×M×F×106]÷W=16.7×ΔA× F÷W

V：提取液體積，1×10-3L，ε：花色苷的摩爾消光系數，2.69×104 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；M：花色苷的相對分子質量：449.2g/mol；F：稀釋倍數；106：1g=106μg；W：樣本干重：g。

ΔA線性范圍為0.005-1。

注意：

1. 本產品僅供科研使用。請勿用于醫藥、臨床診斷或治療，食品及化妝品等用途。請勿存放于普通住宅區。
2. 為了您的安全和健康，請穿好實驗服并佩戴一次性手套和口罩操作。

原創作者：上海莼試生物技術有限公司

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