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標(biāo)簽:甲基檸檬酸合酶(metheyl-citrate synthase MCS)試劑盒
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產(chǎn)品名稱 | 檢測方法 | 規(guī)格 | 貨號 |
甲基檸檬酸合酶(metheyl-citrate synthase,MCS)試劑盒 | 分光光度法 | 25管/24樣 | CS-01S63413 |
MCS廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體基質(zhì)中,與檸檬酸合酶(CS)共同參與三羧酸循環(huán)的調(diào)節(jié)。
測定原理:
MCS催化丙酰CoA和草酰乙酸產(chǎn)生甲基檸檬酰輔酶A,進(jìn)一步水解產(chǎn)生甲基檸檬酸;該反應(yīng)促使無色的DTNB轉(zhuǎn)變成黃色的TNB,在 412nm處有特征吸光值。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰、無水乙醇和蒸餾水
試劑組成和配制:
試劑一:液體25mL×1瓶,-20℃保存;
試劑二:液體5mL×1瓶,-20℃保存;
試劑三:液體0.5mL×1支,-20℃保存;
試劑四:液體25mL×1瓶,4℃保存;
試劑五:粉劑×1支,4℃保存,臨用前加入800μL無水乙醇;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。
試劑六:粉劑×2支,-20℃保存,臨用前加入400μL蒸餾水;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。
試劑七:粉劑×1支,-20℃保存,臨用前加入800μL蒸餾水;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復(fù)凍融。
樣本的前處理:
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:
①稱取約0.1g組織或收集500萬細(xì)胞,加入1mL試劑一和10uL 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
②將勻漿600g,4℃離心5min。
③棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心10min。
④上清液即胞漿提取物,可用于測定從線粒體泄漏的CS(此步可選做)。
⑤在步驟④中的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3秒,間隔10秒,重復(fù)30次),用于線粒體CS測定。
測定步驟:
1、分光光度計預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至412nm,蒸餾水調(diào)零。
2、將試劑四、五、六和七在37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)孵育5min。
3、樣本測定
將上述試劑按順序加入1 mL玻璃比色皿中,加試劑七的同時開始計時,在412nm波長下記錄20秒時的初始吸光度A1和反應(yīng)2min后的吸光值A2,計算ΔA=A2-A1。
MCS活性計算:
(1)按樣本蛋白濃度計算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。
MCS(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1100×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。
(2)按樣本鮮重計算:
單位的定義:每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。
MCS(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=222.2×ΔA÷W
(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算:
單位的定義:每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。
MCS(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.4444×ΔA
V反總:反應(yīng)體系總體積,9×10-4 L;ε:TNB摩爾消光系數(shù),1.36×104 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.03 mL;V樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應(yīng)時間,2 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500萬。
原創(chuàng)作者:上海莼試生物技術(shù)有限公司
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