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產品名稱 | 檢測方法 | 規格 | 貨號 |
山梨醇脫氫酶(sorbitol dehydrogenase,SH)試劑盒 | 分光光度法 | 50管/48樣 | CS-01S63418 |
SH(EC
測定原理:
SH催化山梨醇脫氫生成果糖,同時還原NAD+生成NADH,測定340nm吸光度增加速率可以計算SH活性。
需自備的儀器和用品:
紫外分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、1mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制:
提取液:液體60mL×1瓶,4℃保存;
試劑一:液體20mL×1瓶,4℃保存;
試劑二:粉劑×1瓶,4℃保存;臨用前每瓶加入15mL蒸餾水,用不完的試劑仍4℃保存。
試劑三:粉劑×1瓶,-20℃保存;臨用前每瓶加入15mL蒸餾水,用不完的試劑仍-20℃保存。
粗酶液提取:
1、細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2、組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
3、血清(漿)樣品:直接檢測。
測定步驟:
1、分光光度計預熱30min以上,調節波長至340nm,蒸餾水調零。
2、樣本測定
將上述試劑按順序加入1 mL玻璃比色皿中,加樣本的同時開始計時,記錄 20秒時的初始吸光度A1和2分20秒時的吸光度A2,計算ΔA=A2-A1。
SH活性計算:
1、血清(漿)SH活力的計算
單位的定義:每毫升血清(漿)每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
SH(nmol/min/mL)= [ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷V樣÷T=1688×ΔA
2、組織、細菌或細胞中SH活力的計算:
(1)按樣本蛋白濃度計算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
SH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1688×ΔA÷Cpr
(2)按樣本鮮重計算:
單位的定義:每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
SH(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=1688×ΔA÷W
(3)按細菌或細胞密度計算:
單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。
SH(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=3.376×ΔA
V反總:反應體系總體積,1.05×10-3 L;ε:NADH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.05 mL;V樣總:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,2 min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數,500萬。
原創作者:上海莼試生物技術有限公司
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