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產品名稱 | 檢測方法 | 規格 | 貨號 |
糖化酶(Glucoamylase)試劑盒 | 分光光度法 | 50管/24樣 | CS-01S63443 |
糖化酶,即葡萄糖淀粉酶(EC
測定原理
糖化酶水解可溶性淀粉生成葡萄糖,與3,5-二硝基水楊酸生成紅棕色化合物,在540nm處有最大光吸收,在一定范圍內反應液顏色深淺與葡萄糖的量成正比,可測定計算得糖化酶的活力。
自備實驗用品及儀器
天平、低溫離心機、可見分光光度計、1 mL玻璃比色皿、恒溫水浴鍋。
試劑組成和配制
提取液:液體50mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:液體25mL×1瓶,4℃保存。
試劑二:液體25mL×1瓶,4℃避光保存。
酶液提取
1.組織:按照質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g,加入1mL提取液)加入提取液,冰浴勻漿后于4℃,10000g離心10min,取上清置于冰上待測。
2.細胞:按照細胞數量(104個):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時間3min);然后4℃,10000g離心10min,取上清置于冰上待測。
3.培養液或其它液體:直接檢測。
測定操作
酶活性計算公式
標準曲線:y = 0.2164x - 0.0182,R2 = 0.9992
1. 按照蛋白含量計算
酶活性定義:在40℃,pH4.6條件下,每毫克蛋白每分鐘分解可溶性淀粉產生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。
糖化酶活性(U/mg prot)=(△A+0.0182)÷ 0.2164×V反總÷(V樣×Cpr)÷T
= 2.54×(△A+0.0182)÷ Cpr
2. 按照樣本質量計算
酶活性定義:在40℃,pH4.6條件下,每克組織每分鐘分解可溶性淀粉產生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。
糖化酶活性(U/g 鮮重)=(△A+0.0182)÷ 0.2164×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T
= 2.54×(△A+0.0182)÷ W
3.按照液體體積計算
酶活性定義:在40℃,pH4.6條件下,每毫升培養液每分鐘分解可溶性淀粉產生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。
糖化酶活性(U/mL)=(△A+0.0182)÷ 0.2164×V反總÷V樣÷T
= 2.54×(△A+0.0182)
4.按照細胞數量計算
酶活性定義:在40℃,pH4.6條件下,每104個細胞每分鐘分解可溶性淀粉產生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。
糖化酶活性(U/104cell)=(△A+0.0182)÷ 0.2164×V反總÷(V樣×細胞數量(萬個)÷V樣總)÷T
= 2.54×(△A+0.0182)÷ 細胞數量(萬個)
V反總:反應總體積,0.55mL,V樣:反應體系中加入樣本體積,0.05mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;T:反應時間,30min
注意事項
1.滅活樣本的制備建議將樣本放在沸水浴中煮沸10min,以將酶徹底滅活。
2.測定之前進行預實驗,若吸光值較高,請將樣品用提取液進行適當的稀釋再測定,并在計算公式中乘以稀釋倍數。
原創作者:上海莼試生物技術有限公司
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