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產品名稱 | 檢測方法 | 規格 | 貨號 |
乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)試劑盒 | 分光光度法 | 50管/24樣 | CS-01S63445 |
LDH(EC
測定原理:
LDH催化NAD+氧化乳酸生成丙酮酸,丙酮酸進一步與2, 4 - 二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙,在堿性溶液中顯棕紅色,顏色深淺與丙酮酸濃度成正比。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、1 mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
提取液:30mL×1瓶, 4℃保存;
試劑一:液體15 mL×1瓶, 4℃保存;
試劑二:粉劑×1支,-20℃保存,用時加入10μL試劑五和1.3 mL蒸餾水充分溶解備用,用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融;
試劑三:液體15 mL×1瓶,4℃保存;
試劑四:液體50 mL×1瓶,4℃保存;
試劑五:液體100μL×1支,4℃保存;
樣品測定的準備:
1、細菌、細胞或組織樣品的制備:
細菌或培養細胞:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數量(104個):提取液體積(mL)為1000~5000:1的比例(建議2000萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10s,重復30次);8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2、血清(漿)樣品:直接檢測。
測定步驟:
1、分光光度計預熱30min以上,調節波長至450nm,蒸餾水調零。
2、樣本測定(在EP管中加入下列試劑)
充分混勻,室溫靜置15分鐘,450 nm下測定吸光度,計算ΔA=A測定管-A對照管。每個測定管需要設一個對照管。
LDH活力單位的計算:
1、標準條件下測定的回歸曲線, y = 0.9108x+0.0037 (x為標準品濃度,umol/mL;y為ΔA)。
2、血清(漿)LDH活力的計算
單位的定義:每mL血清(漿)每分鐘催化產生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。
LDH(nmol/min/mL)=(ΔA-0.0037)÷0.9108÷T×103=73.2×ΔA
3、細胞、細菌和組織中LDH活力的計算
(1)按樣本蛋白濃度計算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘催化產生1 nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。
LDH(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0037)÷0.9108×V1]÷(V1×Cpr)÷T×103 =73.2×ΔA÷Cpr
需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒。
(2) 按樣本鮮重計算:
單位的定義:每g組織每分鐘催化產生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。
LDH(nmol/min/g鮮重)=[(ΔA-0.0037)÷0.9108×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×103 =73.2×ΔA÷W
(3)按細菌或細胞密度計算:
單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘催化產生1nmol丙酮酸定義為一個酶活力單位。
LDH(nmol/min/104 cell)= [(ΔA-0.0037)÷0.9108×V1]÷(2000×V1÷V2)÷T×103 =0.037×ΔA
V1:加入反應體系中樣本體積,0.05mL;V2:加入提取液體積,1 mL;T:反應時間,15 min;Cpr:蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;2000:細胞或細菌總數,2000萬。
1、標準曲線線性范圍為:0.1 umol/mL -2 umol/mL。
2、ΔA線性范圍為:0.01 -2。
原創作者:上海莼試生物技術有限公司
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