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產品名稱 | 檢測方法 | 規格 | 貨號 |
類黃酮糖基轉移酶(UFGT)試劑盒 | HPLC法 | 50管/48樣 | CS-01S63533 |
類黃酮是植物次生代謝產物,糖基化是類黃酮基本結構形成的最主要的修飾反應之一,提高了類黃酮苷元的化學穩定性,這一過程主要由類黃酮糖基轉移酶催化的,使類黃酮-OH與UDPG反應,是黃酮合成途徑中的關鍵酶。
測定原理
類黃酮糖基轉移酶催化花青素與尿苷二磷酸葡萄糖反應產生花青苷,主要以矢車菊素3-葡萄糖苷(C3G)形式存在,用HPLC檢測產物可反映類黃酮糖基轉移酶的酶活性。
自備實驗用品及儀器
天平、研砵、離心機、恒溫水浴鍋、100目篩、高校液相色譜、針頭過濾器(水系、0.22μm)、濾膜(水系、0.45μm)、耐水C18柱(4.6×250mm)、樣品瓶、甲酸、甲醇(色譜級)、超純水
試劑組成和配制
提取液:液體50mL×1瓶,4℃保存。
試劑一:粉劑×1瓶,4℃避光保存。臨用前加全部試劑三溶解。
試劑二:液體5mL×1瓶,4℃保存。
試劑三:液體8mL×1瓶,4℃保存。
標準品:標準品×1支,-20℃保存。
樣本處理
組織:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:2~5的比例(建議稱取約0.5g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿。10000g ,4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
實驗前的準備工作
1、檢測產物制備
2、將500 mL超純水和500 mL甲醇用0.45 μm的濾膜抽濾,以除去溶劑中的雜質,防止堵塞色譜柱。(注:蒸餾水用水系濾膜抽濾,甲醇用有機系濾膜抽濾)。
3、流動相的配制:流動相A為1.6%甲酸水溶液; 流動相B為1.6%甲酸甲醇溶液。
4、將配好的流動相超聲30分鐘,以脫去溶劑中的氣泡,防止堵塞色譜柱。
5、標準品的配制:
在標準品中加入1mL甲醇,配成5μmol /mL 母液,將母液用甲醇分別稀釋成2μmol/mL ,1μmol/mL 、0.5μmol/mL 、0.25μmol/mL、0.125μmol/mL的標準品溶液。針頭式過濾器過濾后待測。
測定操作步驟
1. 開啟電腦、檢測器和泵,安裝上色譜柱,打開軟件,在方法組中設置進樣量10 μL,梯度洗脫為0~5min,85%A+15%B; 5~10min,85%A+15%B; 10~30min,80%A+20%B; 30~30.1min, 60%A+40%B; 30.1~40min,0%A+100%B。流速1mL/min,柱溫30℃,走樣時間為50min,檢測波長530nm,設置完畢保存方法組。
2.初始設置流動相A=85%,流動相B=15%,流速1 mL/min,待基線穩定后開始加樣。
3.加入標準品10 μL,在50min內可分離C3G,C3G的保留時間在25min左右,(柱子不同,保留時間有差異),計算不同濃度的C3G標準品的峰面積。
4. 加入樣品10 μL,在相應保留時間處檢測C3G的峰面積。
酶活計算:
1.以標準品濃度(μmol/mL)為橫坐標,峰面積為縱坐標計算C3G標準曲線。將樣品峰面積代入標準曲線,計算樣品C3G含量。
2.酶活單位定義:
A.每毫克組織蛋白每分鐘催化反應產生1μmolC3G定義為一個酶活單位。
UFGT活性(μmol/min/mg prot)= C×V反總÷(V樣×Cpr)÷ T
=0.117×C÷Cpr
B.每克組織每分鐘催化反應產生1μmolC3G定義為一個酶活單位。
UFGT活性(μmol/min/g 鮮重)= C×V反總÷(V樣×W÷V樣總)÷ T
=0.117×C÷W
C:C3G濃度,μmol/mL ;V反總:反應總體積,0.35mL;V樣:加入樣本量,0.1mL,V樣總:加入提取液體積,1mL,Cpr:蛋白含量,mg/mL;W:樣本質量,g,T:反應時間,min
注意事項:
1、流速由小到大調節,避免柱壓過大。
2、使用完畢時,先用50%的甲醇水溶液洗色譜柱45min,再用純甲醇沖洗色譜柱30min。
3、標準品的稀釋倍數要根據樣品中C3G濃度確定,樣品中C3G的峰面積必須落在不同濃度的C3G標準品的峰面積之內,該標準品稀釋倍數只是一個參考。
原創作者:上海莼試生物技術有限公司
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