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產品名稱 | 檢測方法 | 規格 | 貨號 |
氨基比林-N-脫甲基酶(AND)活性測定試劑盒 | 微量法 | 100管/48樣 | CS-01S63566 |
細胞色素P450酶是一組在外源物質代謝中,尤其是藥物和毒物,具有重要作用的酶系。AND作為P450酶系的重要一員,相當于CYP3A4亞型,與藥物的去甲基化反應密切相關。
測定原理:
AND催化氨基比林釋放甲醛,通過Nash比色法測定甲醛含量,即可計算出AND活性。
自備儀器和用品:
普通離心機,超速離心機、水浴鍋、可調式移液槍、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水、無水乙醇和冰。
試劑組成和配制:
試劑一:粉劑×1瓶,4℃保存。臨用前加100mL蒸餾水充分溶解。
試劑二:液體×1瓶,4℃保存。
試劑三:粉劑×1管,4℃避光保存。臨用前加入1mL無水乙醇,充分溶解。
試劑四:粉劑×1管,4℃保存。臨用前加入0.5mL蒸餾水,充分溶解。
試劑五:粉劑×1瓶,室溫保存。臨用前加蒸餾水4mL充分溶解。
試劑六:液體×1瓶,室溫保存。
試劑七:液體×1瓶,4℃保存。
標準液:液體×1瓶,-20℃保存。臨用前取1.5mL EP 管,加入10μl標準液,加990μl蒸餾水,混勻即為0.05 mmol/L標準甲醛溶液,4℃保存。
粗酶液提?。?/span>
1、除去細胞核,線粒體等大分子物質:稱約0.5g組織,加入1 mL試劑一,冰上充分研磨,10 000g 4℃離心30min,取上清液轉入超速離心管。
2、粗制微粒體:4℃,100 000g,離心60min,棄上清液。
3、除血紅蛋白等雜質:向步驟2的沉淀中加1mL試劑一,蓋緊后充分震蕩溶解,100 000g離心30min,棄上清液。
4、最終微粒體:向步驟3的沉淀中加試劑二0.5 mL,蓋緊后充分震蕩溶解,即粗酶液,待測。該待測液需當天使用。
AND活性測定操作:
1. 分光光度計/酶標儀預熱30 min,調節波長到412 nm,蒸餾水調零。
2. 試劑二置于37℃水浴中預熱30min。
3. 對照管:取1支EP管,加入10μL粗酶液,170μL試劑二,10μL試劑三,10μL蒸餾水,混勻后置于37℃水浴保溫30min;立即加入35μL試劑五,混勻后置于冰浴中5min;取出后加入35μL試劑六,混勻后室溫靜置5min;室溫8000rpm離心5min;取新的EP管,加入100μL上清液,100μL試劑七,混勻后60℃水浴10min,然后取出,用冷水冷卻5min,于412nm測定光吸收,記為A對照管。
4. 測定管:取1支EP管,加入10μL粗酶液,170μL試劑二,10μL試劑三,10μL試劑四,混勻后置于37℃水浴保溫30min;立即加入35μL試劑五,混勻后置于冰浴中5min;取出后加入35μL試劑六,混勻后室溫靜置5min;室溫8000rpm離心5min;取1支新EP管,加入100μL上清液,100μL試劑七,混勻后60℃水浴10min,然后取出,用冷水冷卻5min,于412nm測定光吸收,記為A測定管。
5. 標準管:取1支EP管,加入100μL標準品,100μL試劑七,混勻后60℃水浴10min,然后取出,用冷水冷卻5min,于412nm測定光吸收,記為A標準管。
注意:每個樣品都需要做對照管。
AND活性計算:
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
(1)按蛋白濃度計算
活性單位定義:37℃中每分鐘每毫克蛋白催化產生1nmol甲醛為1個酶活單位。
AND活性(nmol/min/mg prot) = C標準品× V標準品×(A測定管-A對照管)÷A標準管× 稀釋倍數÷(Cpr×V樣)÷T
= 45×(A測定管-A對照管)÷A標準管÷Cpr。
(2)按樣本質量計算
活性單位定義:37℃中每分鐘每克組織催化產生1nmol甲醛為1個酶活單位。
AND活性(nmol/min/g 鮮重 ) = C標準品×V標準品×(A測定管-A對照管)÷A標準管×稀釋倍數÷(V樣÷V樣總×W)÷T
= 45×(A測定管-A對照管)÷A標準管÷W。
C標準品:0.05 mmol/L=50μmol/L;V標準品:500μL=0.0005 L;稀釋倍數:V反總÷V上清液=(50+850 +50+50+175+175)÷500=2.7;Cpr:粗酶液蛋白質濃度(mg/mL),需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒;V樣:加入粗酶液體積,50μL=0.05mL;V樣總:提取液體積,0.5mL;T:催化反應時間(min),30min。
b.使用96孔板測定的計算公式如下
(1)按蛋白濃度計算
活性單位定義:37℃中每分鐘每毫克蛋白催化產生1nmol甲醛為1個酶活單位。
AND活性(nmol/min/mg prot) = C標準品×V標準品×(A測定管-A對照管)÷A標準管× 稀釋倍數÷(Cpr×V樣)÷T
= 45×(A測定管-A對照管)÷ A標準管÷ Cpr。
(2)按樣本質量計算
活性單位定義:37℃中每分鐘每克組織催化產生1nmol甲醛為1個酶活單位。
AND活性(nmol/min/g 鮮重) = C標準品×V標準品×(A測定管-A對照管)÷A標準管×稀釋倍數÷(V樣÷V樣總×W)÷T
= 45×(A測定管-A對照管)÷ A標準管÷W。
C標準品:0.05 mmol/L=50μmol/L;V標準品:500μL=0.0005 L;稀釋倍數:V反總÷V上清液=(50+850 +50+50+175+175)÷500=2.7;Cpr:粗酶液蛋白質濃度(mg/mL),需要另外測定,建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒;V樣:加入粗酶液體積,50μL=0.05mL;V樣總:提取液體積,0.5 mL;T:催化反應時間(min),30min。
注意事項:
1、粗酶液需在當日完成測定,如需保存,則向粗酶液提取步驟3的沉淀中加0.5ml 20%的甘油,分裝后,-80℃保存;
2、試劑三和試劑四需臨用前配制,如當天沒有用完,4℃避光保存,可用1周;
3、粗酶液可直接用于蛋白濃度測定,建議用BCA法測蛋白含量。
原創作者:上海莼試生物技術有限公司
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